真菌的分离培养及形态观察和无菌操作

1、真菌的分离培养及形态观察、真菌的分离培养方法（）平板划线分离法1取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45，注入无菌平皿中，每皿1520ml，制成平板待用。2取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。3将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法。4划线完毕，置温箱中培养25d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离

2、的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。（二）稀释分离法1取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。2用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。3用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。然后倒置温箱中培养，25d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。

3、二真菌培养性状观察（一）真菌在固体培养基上的生长表现1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色或红色等。2. 霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养25d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直径12mm或更小）。很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。 （二）真菌在液体培养基中的生长表现1. 酵母菌 注意观察其混浊度、沉淀物及表面生长性状等。

4、2. 霉菌 霉菌在液体培养基中生长，一般都在表面形成菌层，且不同的霉菌有不同的形态和颜色。三 真菌的形态观察（一）真菌水浸片的制备及观察常用美兰染色液制备真菌水浸片来观察真菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无色，故可区别死细胞、活细胞。1. 酵母菌水浸片的制备将美兰染色液一滴滴加在干净的载玻片中央，如不染色则加蒸馏水一滴，用接触环以无菌操作取培养48h左右的酵母菌体少许，在液滴中轻轻涂抹均匀（液体培养物可直接取一接种环培养液于玻片上）并加盖干净盖玻片。为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢慢放下盖片。然后置于显微镜载物台上进行观察，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可以根据是否染上颜色来

5、区别死、活细胞。2. 霉菌水浸片的制备在干净载玻片上加蒸馏水或美兰染色液一滴。取培养25d的根霉或毛霉、培养35d的曲霉、青霉或木霉、培养2d左右的白地霉同上法制片。霉菌要选择有无性孢子的菌体，用解剖针挑取少量菌丝体放在载玻片的液滴中，将玻片置于解剖镜下，细心地用解剖针将菌丝体分散成自然状态，然后加盖玻片，注意不要让其产生气泡，盖后不再移动玻片，以免弄乱菌丝。制好片后，就可以在显微镜下观察。观察时注意它们的菌丝有无隔膜、孢子囊柄与分生孢子柄的形状、分生孢子小梗的着生方式、孢子囊的形态、足细胞与假根的有无、孢子囊孢子和分生孢子的形状和颜色、节孢子的形状和特点等。并且要区别根霉与毛霉、青霉、曲霉、

6、木霉之间的异同点以及白地霉的特点。 （二）霉菌封闭标本的制备霉菌的封闭标本，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使标本不宜干燥，而石炭酸又有防腐作用。在封片液中，还可加入棉蓝或其它酸性染料，以便于观察菌体。在洁净载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取少许带有孢子的菌丝于染液中，再细心地把菌丝挑成自然状态，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。在温暖干燥室内放数日，让水分蒸发一部分，使盖玻片与载玻片紧贴，即可封片。封片时，先用清洁的纱布或脱脂棉将盖玻片四周擦净，并在盖玻片周围涂一圈加拿大树胶或合成树胶，风干后即成封闭标本。（三）真菌的载片培养真菌的载片培养法不仅可克服水浸

7、片制片的困难，还可使对菌丝分枝和孢子着生状态的观察获得更满意的效果。取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部（图5-1），上放一U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖进行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭菌后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。为防止培养过程中培养基干燥，可在滤纸上滴加灭菌20甘油液34ml，然后盖上平皿盖，即成所谓湿室载片培养。放在适宜温度（多数真菌为2030）的培养箱内培养，定期取出在低倍镜下观察

8、，可以看到孢子萌发、发芽管的长出、菌丝的生长、无隔菌丝中孢子囊柄与孢子囊孢子形成的过程、有隔菌丝上足细胞生长、锁状联合的发生、孢子着生状态等。无菌操作原则：一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。 二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。 三、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。 四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 五、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。

9、六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。 七、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。 无菌操作技术及注意事项1、玻璃器皿的消毒和清洁 新购玻璃器皿的处理新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用12%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。 污染玻璃器皿的处理 一般试管或容器可用3煤酚皂溶液或5石

10、炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在35漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。 细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌1530分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。 吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。 油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。 染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所

11、以不宜用肥皂的碱水洗涤。 玻片可置于3煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。 2、无菌器材和液体的准备将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120的干燥箱中干燥灭菌小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20分钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤器负压抽滤后使用。 3、无菌操作过程在无菌操作过程中，最重要的是要保

12、持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前2030分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。培养瓶应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。 4、常用清洁液的配制法重铬酸钾清洁液：可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。先将重铬酸钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。注意，此时可产生高热，应防止容器破裂。重铬酸钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和衣服。为防止吸收空气的水分而变质，此液应贮存于带盖的容器中。如清洁效力较差，可再加入少量重铬酸钾及浓硫酸，还可继续使用。直到液体变蓝绿色，即不能再用。配制重铬酸钾清洁液时，宜用耐高温的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿