CTAB法提取植物基因组DNA

1、请下载支持！蒂羇薀蝿蚅膇膁CTAB 法提取植物基因组 DNA莈葿芀薄蚇罿膂 CTAB 法原理芇螁莂膈袈蚂薅 CTAB（Cetyltrimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵 ，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。节薅莅蚇衿蒄蚄 当降低溶 液盐浓度到一定程度（ 0.3 mol/L NaCl）时， CTAB- 核酸的复合物从溶液中沉淀 ，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA ，而 CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去莄袆袀莀莂膅莀 在

2、高离子强度的溶液中 (>0.7mol/L NaCl) ， CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。 CTAB 溶液在低于 15时会形成沉淀析出 ，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15。另外，它还能保护 DNA 不受内源核酸酶的降解。莆蚈袁蒅薆艿蚂 主要试剂与溶液的配制：薇芁芄肇肈膃芃 PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）螂膃薈芁蒀莅袇 巯基乙醇芅螄聿袁膄莈蚀 氯仿异戊醇（ 241）芅羈莁肃薅葿芃 异丙醇螇袂膆肅莇蒀膄 70%乙醇莃肄薆蒀羀羃螆Tris- 苯酚袃羇荿蒁袂芆袀 RNaseA蒈膈羂羄螇螈薀 无水乙醇芀蒃螃芈蚇肀螂 CTAB 溶液： CTA

3、B 20g/L虿蚂蒅螀薁袅螄 NaCl（58.44） 1.4 mol/L （ 81.816g）螅羅蕿肂螃膅腿 EDTA （292.25） 10 mmol/L（ 2.9225g）蒆蒇薃薂蚆肈膀 Tris（ 121.14） 100 mmol/L （12.114g）薀蝿蚅膇膁蚁蚃 pH 8.0芀薄蚇罿膂蒂羇 1×TE 缓冲液： EDTA（ 292.25） 1 mmol/L （ 0.29225g）莂膈袈蚂薅莈葿 Tris（ 121.14） 10 mmol/L （1.2114g）莅蚇衿蒄蚄芇螁 pH 8.0袀莀莂膅莀节薅 NaAC 溶液： NaAC（ 82.03） 3mol/L （ 246.0

4、9g）袁蒅薆艿蚂莄袆 pH 4.0芄肇肈膃芃莆蚈 植物总 DNA 的提取薈芁蒀莅袇薇芁 1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加 PVP（聚乙烯吡咯烷酮 K30）少许，成粉末后转入 10mL的离心管中，放入液氮或 -80冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的 DNA 量可以相差几倍， 所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。聿袁膄莈蚀螂膃 2、将（ 200ml ）CTAB 溶液放于 65水浴锅中预热。莁肃薅葿芃芅螄 3、加 4ml 巯基乙醇到预热的 200mlCTAB 中。膆肅莇蒀膄芅羈 4、速加 3ml预热的 CTAB 到装有粉末的 10mL离心管中，之后放入 65水浴

5、锅中， 保温3060min，期间轻摇数次 （一般 20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动， 之后的晃动一定要轻柔）。请下载支持！薆蒀羀羃螆螇袂 5、加入 34ml氯仿异戊醇（241（）在通风橱中操作），轻摇混匀至乳白色（ 100200 次，剧烈晃动会使 DNA 机械切割）。荿蒁袂芆袀莃肄 6、1520，11000 rpm离心 15min（CTAB 配平，相对应的离心管，质量相差 <0.03g）。羂羄螇螈薀袃羇 7、取上清（ 用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把 DNA 链弄断。 ），加 0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，可放入4冰箱过夜）。螃芈蚇肀螂蒈膈 8、用毛细玻璃

6、管将 DNA 絮状物挑出（ DNA 絮状物尽量要挑出，不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的 DNA 也增多）（或 4，10000 rpm离心 5min，弃上清），放入新的离心管中，用 70%乙醇漂洗 2次，放置超净台中吹干。蒅螀薁袅螄芀蒃 9、加入 2ml 1×TE缓冲液溶解，可放入 4冰箱保存 （酶活性在 4或 65水浴中最低，防止酶降解 DNA ）。蕿肂螃膅腿虿蚂 10、未溶解的，可放入 65水浴中促其溶解， 10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。薃薂蚆肈膀螅羅 11、加入 2.5ul RNaseA（RNaseA提前拿出融化）， 10离心，升至 4000 rp

7、m即停，使RNaseA和溶液充分混合。蚅膇膁蚁蚃蒆蒇 12、37水浴，保温 1h。蚇罿膂蒂羇薀蝿 13、加入 1ml Tris- 苯酚、 1ml氯仿异戊醇（ 241），摇均配平， 4， 11000 rpm离心 10min 。袈蚂薅莈葿芀薄 14、取上清，加1×TE补至 2ml，加 2ml氯仿异戊醇（ 241）摇均配平， 4，11000 rpm离心 10min 。衿蒄蚄芇螁莂膈 15、如仍有白色蛋白质沉淀，则重复步骤14。莂膅莀节薅莅蚇 16、取上清，加 0.1倍上清液体积的 NaAC ，2.5倍上清液体积的无水乙醇（提前放入-20冰箱），摇均，放入 -20冰箱沉淀 30min。薆艿蚂

8、莄袆袀莀 17、用毛细玻璃管将 DNA 挑出（或用无水乙醇配平， 4， 10000 rpm离心 4min，弃上清），放入新的离心管中，用 70%乙醇漂洗 2次，转入 1.5ml离心管，放置超净台中吹干。肈膃芃莆蚈袁蒅 18、将 DNA溶于适量的 1× TE缓冲液中，短期 4保存，长期 -80冰箱中储存。蒀莅袇薇芁芄肇 19、取少量 DNA 溶液进行琼脂糖电泳，胶浓度为0.8%，检测其完整性。并用紫外分光光度计测其浓度。膄莈蚀螂膃薈芁 注解：薅葿芃芅螄聿袁 1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质， 有效去除多酚，减少 DNA 中酚的污染；同时它也能

9、和多糖结合，有效去除多糖。莇蒀膄芅羈莁肃 2、 CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；羀羃螆螇袂膆肅 3、 NaCl：提供一个高盐环境，使 DNA 充分溶解，在于液相中；袂芆袀莃肄薆蒀 4、 EDTA：螯合 Mg2+ 或 Mn2+ 离子，抑制 DNase 活性；螇螈薀袃羇荿蒁 5、 Tris (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；蚇肀螂蒈膈羂羄 6、-巯基乙醇：是抗氧化剂 ，有效地防止酚氧化成醌， 避免褐变， 使酚容易去除。薁袅螄芀蒃螃芈 7、苯酚： 使蛋白质变性， 同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断 ,蛋白分子表面又

10、含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。使用酚的优点： （ 1）有效变性蛋白质；（ 2）抑制了 DNase 的降解作用。缺点：（ 1）能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly(A)RNA 。（ 2）不能完全抑请下载支持！制 RNase的活性。螃膅腿虿蚂蒅螀 8、氯仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中） 。蚆肈膀螅羅蕿肂 9、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相， 使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶

11、剂相维持稳定。膁蚁蚃蒆蒇薃薂 基因组 DNA 提取常见问题：膂蒂羇薀蝿蚅膇 1、 DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质：重新纯化 DNA ，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀 DNA 。薅莈葿芀薄蚇罿 2、DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数 (2-3 次)蚄芇螁莂膈袈蚂 3、 DNA 中有 RNA 的存留：加入 RNase降解 RNA 。莀节薅莅蚇衿蒄 4、材料不新鲜或反复冻融：尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。蚂莄袆袀莀莂膅 5、未很好抑制内源核酸酶的活性：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA 时，可增加裂解液中螯合剂的含量。芃莆蚈袁蒅薆艿 6、提取过程操作过于剧烈， DNA 被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。袇薇芁芄肇肈膃蚀螂膃薈芁蒀莅7、外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。8、反复冻融。将DNA 分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。芃芅螄聿袁膄莈 冰冻材料提出高质量的基因组DNA ，应确保以下几点：膄芅羈莁肃薅葿螆螇袂膆肅莇蒀1、确保采样后立即投入液氮中保存。2、在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。袀莃肄薆蒀羀羃 研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料