细胞工程课件总结

1、第一章 绪论：1. 细胞工程答：以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用的物质的过程。或：1)广义的细胞工程:包括所有的生物组织、器官及细胞 离体操作和培养技术； 2)狭义的细胞工程:则是指细胞融合和细胞培养技术。2.细胞的全能性 答：细胞具有发育成一个完整个体的潜在能力。3.植物组织培养 答：用无菌方法，使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的培养技术的总称（属体外培养）4.外植体 答：由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。5.植株培养

2、答：以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）为外植体的无菌培养。6.胚胎培养 答：以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。7.器官培养 答;以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养。8.组织培养 答：以分离出植物各部位的组织（如分生组织形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。第二章 细胞培养的设备的操作技术： 1.细胞工程实验室它必须满足哪三个基本的需要？ 答：1） 实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）； 2）无菌操作； 3） 控制培养。2.无菌操作室并非无菌，但应该保持清洁3.思考：紫外灯

3、如何杀菌？操作中要注意什么？ 答：波长200-290mm的紫外线，可透过细菌或病毒的细胞膜对控制着遗传现象和生物机能核酸（DNA）造成机能损伤，使它失去繁殖能力，从而达到杀菌的目的。每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。4.洗涤目的：去除杂物，降低带菌量5.无机盐的作用答：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动； 三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用； 四是在发育过程中

4、，影响组织器官的建成。 6什么是生长素？它在组织培养中的主要作用？答：生长素是指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物。其作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化，促进细胞的伸长，促进生根。第三章 愈伤组织培养 1.外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 2.分化：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官的生活周期。 3.脱分化: 在培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始未分化状态的过程4.再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。 5.愈伤组织:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团薄壁细胞，多在外植

5、体切面上产生。 6.胚状体:对应于胚（embryo），在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。 7.人工种子:指将植物离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。 8.植物组织培养的概念 答：指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。9.植物组织培养的重要意义答：1）加速无性繁殖；2）获取脱毒苗;3）扩大变异范围；4）加速亲本材料的纯化。5）种质资源的试管保存。6）为基因工程的全面实施人工控制遗传方向打下基

6、础。 10.植物细胞的全能性答：每个植物细胞都具有形成完整植株的潜在能力11.胚胎培养 答：以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。12.影响植物组培的因素 答：1.植物因素：(1)基因型，(2) 取材部位、大小、年龄和生理状态2.培养基因素：培养基成分、PH值、渗透压、活性炭。 3.环境因素：(1)光照：包括光强、光质、光周期，(2)温度，(3)湿度，(4)气体。13.体细胞胚与性细胞胚的区分？ 答：体细胞胚是由体细胞组织（一般指愈伤组织）经培养再分化形成；而性细胞胚是由性细胞（包括卵细胞和精细胞）再分化形成。14.（重点 选择题）诱导脱分化过程中细胞形态、结构变化： 答：

7、1）细胞大小没有多大变化；2）细胞质显著变浓；3）大液泡消失；4）RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大并逐渐移位至细胞中央； 5）细胞器增加。15.影响愈伤组织形成的因素答：1）生长调节物质（激素）：影响最大，培养基中加入生长素类有效，尤其2，4D；2）氮源：NH4+、氨基酸、酰胺等有机酸也能促进愈伤组织的发生；3）植物基因型的影响：主要考虑不同植物，或同一植物不同品种（不同基因型）4）植物的来源和年龄：生长点、幼胚、花药、花粉等容易形成胚性愈伤组织；5）其它因素：包括培养温度、光照时间和强度16.（重点）胚状体和不定芽的区别 答；胚状体指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构（胚

8、状体），进而长成完整植株 。不定芽指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株 。 区别：1）胚状体来自单个细胞，具有明显的两极性：分化根端和苗端，而不定芽或不定根都为单向极性。 2）胚状体形成的小植株与周围组织无结构联系 ；而不定芽或不定根往往总是与母体愈伤组织的维管组织相联系。 3）胚状体的维管组织的分布是呈独立的“Y”字形，而不定芽的维管组织无此现象。 17.优良的愈伤组织需具备的相关特性答：1、具有高度的再分化能力，易得到再生植物。2、易散碎，可用于建立优良的悬浮系和分离出全能性的原生质体。3、具有旺盛的自我增殖能力，便于大规模的无性系培养。4、经过长期继代保存而不丧失胚性。18.

9、植物脱毒的意义 答:1)能够有效地保持优良品种的特性；2)生产无病毒种苗，防止品种退化； 3)快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；4)节约耕地，提高农产品的商品率；5)便于运输。19.脱毒方法 答：热处理，愈伤组织培养，茎尖培养，茎尖微体嫁接，化学疗法20.脱毒效果检测 答：外观判断，指示植物鉴定，抗血清鉴定，电子显微镜检查21指示植物是指具有辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。22.影响脱毒效果的因素： 答：1）母体材料病毒侵染的程度；2）起始培养的茎尖大小。第四章 植物细胞培养1分离单细胞的方法 答：1）物理方法：将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液

10、中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好 。2）化学方法:是在细胞悬浮培养中加入草酸盐（能结合细胞间质中果胶钙的钙离子 ）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（对细胞分散有一定的作用）。3)酶法:利用果胶酶和纤维素酶使细胞分离。2.单细胞的培养方法 答：1）平板培养：将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养的方法。2）看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。3）液体浅层培养；4）微室培养（微滴培养）；5）悬浮细胞培养。3.悬浮培养（记） 答：指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。4.悬浮

11、培养的优点答:1)增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；2)在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；3)振荡培养可以适当改善气体的交换；5.悬浮培养过程中细胞生长情况分析测定方法答：1)细胞计数：单位体积细胞浓度；2)细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积；3)细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重6.悬浮细胞培养的同步化方法 答：1）物理方法：体积选择法，冷处理法；2）化学方法：饥饿法，有丝分裂抑制法。7.一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件 答：1）悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；2）均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同； 3）细胞生长迅速。8

12、.悬浮细胞培养方法 答：1）分批培养法：是一种封闭的培养体系，培养过程中不放出培养液，也不补加培养液。2）半连续培养法：在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养成分。3）连续培养法：通过控制连续添加和排出的新老营养液的量，维持培养液体积恒定，据操作的不同又可分为封闭式和开放式两种。9.影响悬浮细胞生长的因素 答：1）起始愈伤组织的质量； 2）接种细胞密度； 3）培养条件：方式、温度；4）继代周期。10.细胞的保存方法 答：1）继代培养保存法；2）低温保存法：510度温度下培养并定期更换培养液；3）冰冻保存法：分为低温保存（20度）和超低温保存（液氮保存）11.细胞培养技术的优点

13、1）培养细胞是在无菌条件下生长的,不受地区、季节和气候限制；2）占地面积少；3）天然产物的生产在控制的条件下进行,可以得到超越整体植物产量的代谢产物；4）能够产生原植物所没有的，甚至是至今在自然界还没有的化合物。12.细胞本身的特性1）细胞体积比微生物细胞大；2）植物细胞生长速度慢；3）植物细胞壁易受机械剪切力的影响；4）细胞常以非均相集合细胞团的方式生长。13.细胞培养液的流变特性答:首先，细胞培养中易结团；其次，细胞培养过程中易产生黏多糖等物质，降低传氧速度，影响细胞生长。14.生物反应器培养过程（重点） 答：1）细胞的驯化、筛选与细胞株的建立；2）扩大培养；3）生物反应器培养。（详细看课

14、件）15.影响生物反应器细胞培养的主要因素 答：1）、细胞遗传特性；2）、培养的环境条件。16.适合大规模培养的细胞株应具备何条件？ 答：1）生长速度快；2）目的代谢产物含量高；3）适合悬浮细胞培养。18.固定化细胞培养的优点(1)固相细胞接触紧密,生长缓慢,细胞拟组织化,有利于次生产物的积累；(2)细胞包埋在聚合物中得到保护，可以减少剪切力的损伤作用；(3)易于把细胞与培养液分开，更有利连续培养及生物转化过程的实现；(4)高密度的细胞群体，可建立细胞间的物化联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的建立，更有利于产物的合成;(5)环境条件易于控制，次生代谢物易于释放。19.两相培养技术：在培

15、养体系中加入脂溶性有机物，或是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔树脂等），使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长和合成次生物质，次生物质分泌出来转到有机相中。 20.前体物作用：消除关键酶的阻碍、阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，大大提高次生代谢物的产量。第五章 植物的原生质体培养1.原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。2.植物原生质体的特点：吸收能力强；具有全能性；在一定条件下可诱导原生质体融合；分泌能力提高；稳定性较差。3.原生质体分离的方法：机械法，酶解法，4.酶解法考虑的因素：A、酶溶剂及其渗透压 1）酶的种类、 2）酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制、P

16、H値。 3）渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。B、酶解时间：酶浓度及温度5.原生质体的收集和纯化方法：沉淀法，漂浮法，沉淀法和漂浮法结合，界面法。6.原生质体的鉴定：目的：检验获得的原生质体是否真正的原生质体鉴定方法(针对有无细胞壁)：1）低渗爆破法： 原生质体在低渗溶液中吸水胀破，观察有无细胞壁碎片；2）荧光染色法：通过荧光增白剂染色后离心去除多余染料，在荧光显微镜下观察（波长3600-4400Å），绿光显示有纤维素，红光示真正的原生质体。7.原生质体活力检测方法：1）染色法 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）

17、。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。 2）胞质环流法：是否存在胞质环流判断原生质体活力；3）渗透压变化法：活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化4）氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧8影响原生质体活力的因素： 1）分离材料的生理状态；2）酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、时间、酶溶液的渗透压；3）分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间；4）环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响。9.原生质体培养方法：固体培养；液体浅层培养；固液双层培养；琼脂糖珠培养10.影响原生质体培养的主要因素：基因型，原生质体的来源，起始培养密度与培养基。1

18、1.植物原生质体培养的应用：1）利用原生质体融合获得融合细胞2）利用原生质体进行外源基因的转化3）利用原生质体再生植株4）利用固定化原生质体培养生产次级代谢产物较多的分泌产物5）利用原生质体进行生物转化：通过原生质体中存在的酶或酶系的催化作用，将酶作用的底物转化为所需的产物，提高转化效率第六章 细胞融合1.细胞融合：指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生,形成新物种的技术。2.细胞融合的意义1）有性杂交变无性杂交,加快育种速度2）打破远缘杂交的不亲和性3）创造新细胞质杂种4）单克隆抗体制备3同核体（homokaryon）：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞；异核体（heterokaryon）

19、：来自不同基因型的杂交细胞4.自发融合：同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并；诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。5体细胞杂交的步骤（以植物细胞为例）1）去除细胞壁以获得大量的原生质体；2）诱导细胞融合形成杂种细胞（细胞相互靠近；形成细胞桥:最关键的一步；胞质渗透；细胞核融合）3）筛选,培养,促进细胞分裂,分化,4）从细胞团,愈伤组织到最后成株6.体细胞杂交的方法：1）生物法：仙台病毒法（原理：病毒被膜具有凝聚细胞的能力，它一边黏连一个细胞的表面，另一边黏连另一个细胞的表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结，诱导细胞的融合）；2）化学法：PEG（PEG分子具有轻微的负

20、极性，与具有正极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合）等；3）物理法：电融合法（原理：改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜形成融合体）。7.核或细胞质失活的方法：1）物理方法：常采用射线处理，如X射线、射线等，使细胞核失活； 2）化学处理：核失活碘乙酰胺、碘乙酸；细胞质失活罗丹明（能抑制线粒体的氧化磷酸化过程）。8.影响原生质体融合的因素：1）原生质体质量；2）融合方法：PEG诱导法；电诱导法.9.体细胞杂种的特点：形态上的趋中性；变异幅度大；非整倍性；双

21、亲性状的共显性；偏亲现象 10.体细胞杂种的鉴定 1）形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。2）细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定（如核型）。3）生化鉴定：同功酶鉴定。4）分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。11.体细胞杂种的应用： 1）植物育种中的核质替换 2）细胞质杂种的获得 3）远缘杂交创造新物种4）细胞器的互作研究12.植物细胞融合：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术13.植物细胞融合的程序1）植物原生质体分离2）原生质体纯化3）原生质体融合4）细胞杂种的选择5）愈伤组织形成器官分化植株再生6）杂种植物鉴定第七章 动物细胞工程1.动物细胞

22、工程是以动物细胞培养技术为主要手段，对动物细胞在离体条件下的细胞形态、结构、生理功能进行研究，在此基础上，采用工程技术手段对细胞的遗传或生理特性进行改造，以获得有价值的细胞产物、器官或个体的生物技术2.动物细胞培养特性：细胞生长缓慢，适应环境能力差，需氧量少，细胞相互粘连以集群形式存在，对环境因素非常敏感，原代培养细胞一般繁殖到50代即退化死亡。3.在离体条件下，细胞一般表现为三种形态：（1）贴壁依赖型（anchorage-dependent)细胞（包括成纤维细胞，上皮型细胞，游走型细胞，多形型细胞）；（2）非贴壁依赖型（anchorage-independent)细胞；（3）兼性贴壁细胞。4

23、.贴壁生长型细胞的生长过程 游离期（悬浮期）：细胞变圆，吸附期：因细胞不同而有差异，吸附到底物（胶原，玻璃，塑料等）上。潜伏期：细胞生长不分裂对数生长繁殖期：细胞呈对数生长，活力最强，适于实验研究。停止期（平台期）：有活力不分裂，接触抑制，密集依赖性。退化期：pH值下降，营养耗尽，产物积累，细胞停止分裂并开始退化。5.细胞为何会贴壁？答：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。而进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团），故细胞会贴壁。6.贴壁生长的优点容易更换培养基；可采用灌

24、注培养；方便产物表达；方便调节培养液与细胞的比例；易于观察等7.胰蛋白酶消化液1）胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。2）胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。3）用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 8.原代培养和传代培养 原代培养：将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养的过程传代培养：细胞在培养瓶中贴壁生长,随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个

25、或两个以上的培养瓶中培养的过程。9.细胞株和细胞系 细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到4050代的传代细胞。细胞株细胞的遗传物质没有发生改变。细胞系：当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去的传代细胞。细胞系的遗传物质发生改变。10.有限细胞系和无限细胞系有限细胞系：指在连续传代培养后，细胞只能在有限的时间存活，最后细胞逐渐死亡。无限细胞系：称为永久细胞系，理论上可以无限传代，但实际上，每次传代后细胞有一定变化（例如，发生染色体丢失），多次传代后必须对细胞再次进行筛选和纯化处理。11.细胞体外培养的要求 环境要求：温度，p