标准曲线制作

1、标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量标准曲线制作(一、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V考马斯亮蓝G250,4.7%(W/V乙醇,8.5%(W/VH3PO4。2、标准蛋白质

2、溶液:纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。(二、器材:1、722S型分光光度计使用及原理(。2、移液管使用(。(三、标准曲线制作:试管编号0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白(ml0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl (ml1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂(ml 5 5 5 5 5 5 5摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm12、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug

3、、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug,在坐标轴上绘制标准曲线。1、利用标准曲线查出回归方程。2、用公式计算回归方程。3、或用origin作图,测出回归线性方程。即A595nm=a×X( +6一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。4、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。(四、蛋白质含量的测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内,依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.10.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A5

4、95nm值,然后再计算。(五、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。4、对照:用被测物质以外的物质作空白对照。药品的配制(磷酸缓冲液的配制一、药品的配制步骤(一、实验准备:1、准备所需的药品和玻璃仪器。2、洗涤。(怎样洗涤算干净?(二、计算:1、百分比浓度计算:1、G/V比例如配1% NaCl,称1g NaCl溶于100ml 水。2、V/V比:例如配75%乙醇100ml,75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇,加25ml蒸馏水。乙醇:乙醚:丙酮=2:1:2配500ml,各取200 ml,100 ml,

5、200 ml混合。3G/V比:用的较少,如计算灰分中某种元素如Fe的含量。2、摩尔浓度计算:注:药品的分子量一般在标签中注明。M=质量/体积(L称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G(g/摩尔质量2、0.1mMNaCl配100mlmM=毫摩尔数/体积(L称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g毫摩尔数=G(mg/摩尔质量3、0.1uNaCl配100mlmM=微摩尔数/体积(L称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg微摩尔数=G(ug/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug3、混合

6、溶液配制的计算:如配3uMEDTA,2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml,用50mM磷酸缓冲液配制。注意:1、分别标定体积计算2、分别配制再混合,但总体积不能为100ml(三、标量:1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器,如量筒或移液管。2、电子分析天平的使用。(四、溶解:1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水,双蒸水,无离子水等。2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右,剩余溶剂洗涤烧杯三次左右,直到洗涤干净。小常识:药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式,可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点(包括溶解性质。如酸碱两性物质的配制(

7、AA、蛋白质、核苷酸等如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解,但pH应在被要求的范围内。3、加热促进溶解,但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:配0.1%的淀粉,水裕加热(温度在80-90。C,过量会糊化。(五、定容:1、用容量瓶定容;2、用玻璃棒引流或用小漏斗;3、用溶剂加入到接近刻度,然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切为止(眼睛可视;4、上下窑洞容量瓶几次,混合均匀即可。(注意不再定容了,防止溶液漏掉。(六、装入试剂瓶,贴上标签。标签应注明以下内容:药品浓度、名称、配制人、配制日期等。(七、清理实验场所。二、磷酸缓冲液的配制。(一、配制0.2mol/L即0.2M

8、pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠磷酸二氢钠做缓冲液。选用药品:Na2HPO412H2O(碱和NaH2PO412H2O(酸配缓冲液100ml。书中说明。(二、计算:1、注:书中有注明配置的量。2、计算:Na2HPO412H2O称取71.64×0.1=7.164gNaH2PO412H2O称取31.21×0.1=3.121g3、含有不同结晶水的换算。书中配1/15mol/L的缓冲液配1L,书中用Na2HPO42H2O需要11.87g/L但用Na2HPO412H2O需多少g?11.87=(178/358×X,X=23.87g。(三、分别配制缓冲液各100ml(根据需要确定配制的量。即:0.2M Na2HPO42H2O和NaH2PO42H2O100ml。(四、按书中的量配制取量再混合。如:pH=6.8,分别去缓冲对49ml和51ml。(五、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值,检