蛋白质分离纯化-基础医学实验

1、一实验项目l蛋白质的盐析与透析蛋白质的盐析与透析l凝胶过滤法分离凝胶过滤法分离Hb与核黄素与核黄素（一）蛋白质的盐析与透析盐析实验原理盐析实验原理: : 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为的过程称为“盐析盐析”。 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜和电荷。蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜和电荷。 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即形成沉淀。分子即形成沉

2、淀。蛋白质的盐析与透析-原理蛋白质的盐析与透析-原理不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。蛋白质的盐析与透析-实验操作 盐析盐析HCl 1-2HCl 1-2滴滴离心分钟离心分钟沉淀沉淀（清蛋白）（清蛋白）透析实验原理透析实验原理: : 蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，蛋白质是大分子物质，

3、它不能透过透析膜，而小分子物质（无机盐、单糖等）可以自由通而小分子物质（无机盐、单糖等）可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液中。入到透析液中。 在实验室分离纯化蛋白质的过程中，常利在实验室分离纯化蛋白质的过程中，常利用透析的方法除去蛋白质溶液中的小分子物质。用透析的方法除去蛋白质溶液中的小分子物质。 按照分子按照分子大小进行大小进行分离。分分离。分离取决于离取决于透析袋截透析袋截留分子量。留分子量。蛋白质的盐析与透析-实验操作 透析透析制备透析袋制备透析袋装样：取透析袋，将一端固定，由开口端加入含有硫酸装样：取透析袋，将一端固定，

4、由开口端加入含有硫酸铵的蛋白沉淀。铵的蛋白沉淀。透析：取透析：取1010倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品的透析袋悬于大烧杯中部。更换洗脱溶液数次（约的透析袋悬于大烧杯中部。更换洗脱溶液数次（约30min30min一一次），至达到透析平衡为止。次），至达到透析平衡为止。检查：（检查：（按教材步骤操作按教材步骤操作）检查洗出液中是否有检查洗出液中是否有NHNH4 4；支试管；支试管蛋白检测：支试管蛋白检测：支试管 又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在分子物质能

5、进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。中的物质就按不同分子量筛分开。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式物质进入凝胶柱之后有两种运动方式, ,垂直向下移垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大, , 无法无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。移动慢。（二）凝胶过滤法分离血红蛋白与核黄素凝胶过

6、滤-原理凝胶层析法分离蛋白质- 原理 血红蛋白（血红蛋白（HbHb，分子量，分子量64,48064,480左右）左右）与核黄素（分子量与核黄素（分子量376376）混合物，由于）混合物，由于分子大小不同，通过分子大小不同，通过Sephadex G-50Sephadex G-50层析层析受阻滞程度有差异，从而达到分离。受阻滞程度有差异，从而达到分离。凝胶层析法分离蛋白质-器材层析柱（1.525ml） 等试剂1.样品液：核黄素、Hb2.Sephadex G-50 Hb的制备抗凝血抗凝血1ml离心离心5分钟分钟3000rpm上清上清沉淀沉淀10ml 0.9%NaCl离心离心5分钟分钟 3000rpm

7、沉淀沉淀上清上清重复两次重复两次4倍体积倍体积 蒸馏水蒸馏水上清上清凝胶层析法分离蛋白质-操作凝胶的制备与装柱：凝胶的制备与装柱： 向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/31/3时，关闭下端时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex G-50Sephadex G-50悬液，悬液，待底部凝胶沉积待底部凝胶沉积12cm12cm时，打开出口，凝胶加至凝胶时，打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约沉积离层析柱口约3cm3cm后，用后，用35

8、倍体积洗脱缓冲液倍体积洗脱缓冲液平衡。平衡。 装柱注意点： 不得有气泡和分层；不得有气泡和分层； 凝胶表面应平整；凝胶表面应平整； 柱床体积稳定；柱床体积稳定； 不能让凝胶表面露出水面。不能让凝胶表面露出水面。凝胶层析法分离蛋白质-操作2. 2.加样：加样： 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将样品缓缓地加到床表面，紧出口，用滴管将样品缓缓地加到床表面，注意尽量不要使平整的床表面搅动，然后打注意尽量不要使平整的床表面搅动，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用洗脱液洗涤出，用洗脱液洗涤 。凝胶层析法分离蛋白质-操作2. 2.洗脱：洗脱： 洗脱时要控制流速为洗脱时要控制流速为4m1/3min4m1/3min。 观察观察HbHb和核黄素的分离。和核黄素的分离。3. 3.凝胶的回收：凝胶的回收： 用蒸馏水洗涤凝胶层