琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程

1、琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程凝胶电泳操作注意事项：1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA 不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA 变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA 的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm 宽的梳子可加的

2、DNA 量，加样量的多少依据加样孔的大小及 DNA 中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA 此现象更明显。5. 电泳系统的变化会影响 DNA 的迁移，加入 DNA 标准参照物进行判定是必要的。6. DNA 样品中盐浓度会影响 DNA 的迁移率， 平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。7. DNA 迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的 DNA 分子，制备琼脂糖凝胶可根据 DNA 分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的 DNA 电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。琼脂糖加样时候注意事

3、项：1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul ，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。 注意电泳期间， 电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。6、 电泳结束后，将胶浸没在1mg/L 的溴化乙锭（ EB ）中， 5min 后即可看到DNA 带，

4、 EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA 结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。7、 在紫外灯下，由于EB 发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA 带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA 。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。8、 如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收 DNA 。琼脂糖核酸电泳实验操作流程1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓

5、度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般2030 ml ）；3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻， 加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下 3045 分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm 为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在 DNA 样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer ），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA 样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负 )。一般 60 100V 电压，电泳20 40min 即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕， 关上电源， 在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。琼脂糖凝胶浓度与线形DNA 的最佳分辨范围琼脂