MicroRNAs在SLE患者外周血中的异常表达

1、MicroRNAs在SLE患者外周血中的异常表达 作者：尹志华, 叶志中, 罗秀霞, 何伟珍, 徐珊【摘要】 目的: 通过比较微小RNAs（microRNAs）在系统性红斑狼疮患者和正常健康对照人外周血单个核细胞中的表达情况, 发现在SLE中异常表达的microRNAs。方法: 分离外周血单个核细胞, 其中SLE患者20例, 健康对照组15例。将SLE患者和健康对照组的PMBC分别混合, 提取总RNA, 分离提纯microRNA, 探针标记, 芯片杂交, 扫描后进行数据分析。以两组间信号强度比值>2或者<0.5表示两组间microRNAs表达差异有统计学意义。结果:

2、 两组共筛选出27种有效表达的人源性microRNAs, 其中SLE组和对照组表达无明显差异的有14种, 11种microRNAs在SLE组中高表达, 2种microRNAs在SLE组中低表达。结论: 多种microRNAs在SLE患者外周血单个核细胞中异常表达, 提示它们可能在SLE的发生发展中起着重要的调控作用。 【关键词】 系统性红斑狼疮 微小RNA 芯片许多生物基因组内存在一类非编码蛋白的RNA基因, 其转录物在某种机制下被加工成长度大约1924个核苷酸的小RNA, 它们被命名为微小RNA（microRNA）。microRNA具有调节其他基因表达的活性, 在不同水平上发挥着发育控制、

3、基因调控、 RNA切割和基因重组等方面的功能, 最近研究显示microRNA在某些疾病如糖尿病、 肿瘤等的发生发展中发挥重要的作用1, 2。而有关在自身免疫性疾病中的作用目前还未有报道, 我们检测了系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）患者和正常健康对照人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC） 中的表达情况, 发现有一系列microRNAs在SLE中异常表达。1 材料和方法1.1 材料 TRIzol购自美国Life Technologies公司; mirVana microRNA分离试剂盒

4、、 mirVanaTM microRNA标记试剂盒购自Ambion公司; Monoreactive Cy3 dye/Monoreactive Cy5 dye购自Amersham Pharmacia Biotech公司; microRNA芯片购自深圳微芯公司; microRNA探针文库来自Invitrogen公司; 芯片点样仪购自GE AMERSHAM公司; PowerMatrix标准Oligo芯片片基购自FULLMOON公司。20例SLE患者（其中女性16例, 男性4例）, 年龄（29.35±8.27）岁, 均符合1982年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准; 15例正常对照人群（其

5、中女性12例, 男性3例）来源于我院体检门诊, 排除高血压、 心脏病、 糖尿病及自身免疫性疾病, 年龄（31.44±6.56）岁。1.2 方法1.2.1 microRNA芯片的制作 microRNA探针文库及根据文献报道和预测分析由微芯公司自行设计合成的探针共1152个, 均为3444碱基长, Tm值一致。其中包括重复点样的331个人类来源的microRNAs、 236个小鼠来源的microRNAs、 189个大鼠来源的microRNAs、 以及142个预测的microRNAs; 其他为各种阴性对照和外参照分子。采用芯片点样仪点制在标准Oligo芯片片基上, 按照标准流程进行固定,

6、干燥保存或用于芯片实验。1.2.2 microRNA的提取 抽取受检人群的外周抗凝血2 mL, 淋巴细胞分离液分离PBMC, 分别将SLE患者组和健康对照组的PBMC混合, 加入TRIzol裂解, 按mirVana分离试剂盒的说明提取总RNA和microRNA, 采用A值测定和电泳检查确定样品总RNA量和质量。1.2.3 microRNA的标记和纯化 利用Poly（A）聚合酶给microRNA样品加Poly（A）尾, 按mirVanaTM标记试剂盒的说明进行microRNA荧光标记和纯化。1.2.4 芯片杂交和数据分析 将荧光标记的microRNA探针变性后加到芯片上, 盖上盖玻片, 放入杂交

7、舱并封好, 放置于42空气浴摇床中以300 RPM速度晃动1824 h。洗片, 干燥后扫描, 将图像转化为基于荧光强度的数字信号(Imagequant 5.0; Array Vision 6.0), 随后进行数据分析和处理。1.2.5 统计学处理 统计学意义判断标准是校正后的两个样品间杂交信号强度的比值, 以比值>2或<0.5代表有明显的表达差异。2 结果2.1 microRNA提取的质量 分别将SLE患者组和健康对照组的PMBC混合后提取总RNA和microRNA, 电泳结果显示两组混合样品总RNA均有清晰的18S和28S条带, A260/A280比值符合要求,

8、样品质量符合实验要求。2.2 microRNA在SLE组和对照组中的表达情况 两组共筛选出38个有效表达的microRNA分子数据, 其中包括10个预测的microRNAs, 27个人类来源的microRNAs和1个小鼠来源的microRNAs。27个人类来源的microRNAs中, SLE组和对照组表达无明显差异的有14个, 在SLE组中高表达的有11个, 低表达的有2个（表1）。表1 SLE组中高表达和低表达的microRNAs（略）*对照组/SLE组比值是经过校正后的相对比值.3 讨论 杂交后microRNA表达谱芯片的扫描结果显示两组样品中有效杂交信号点不多（一共38种表达）, 但是检

9、测到的有效杂交信号强度较高, 其原因主要与样品来源性质有关。因为SLE是全身性的自身免疫性疾病, SLE的发生发展与遗传因素、 环境诱发因素以及机体免疫系统紊乱有关, 其中机体免疫功能紊乱在SLE的发生发展过程中起着至关重要的作用。其免疫学特征为多克隆B细胞自发激活和T细胞功能异常, 产生多种自身抗体。因此我们检测的是SLE患者PBMC中的microRNA表达。许多研究表明相比其他的组织器官（如脑、 心、 肾、 肺等）, PBMC能检测到的表达数量最少。 我们共获取了38种microRNA分子表达的有效数据, 其中大部分microRNAs在SLE组表达比健康对照组强, 说明SLE患者和正常对照

10、人群之间确实存在microRNAs表达差异。从我们的实验数据可以看到, 在SLE患者中高表达的人类来源的microRNAs有let7d,miR106a,miR1423p,miR175p,miR20a, miR20b, miR26b, miR27a, miR342, miR432, miR501。这其中大部分属于mir1792簇, 而mir1792簇在许多肿瘤中也是高表达的。miR175p, miR20a, miR106a可在肺癌、 乳腺癌、 胃癌、 肠癌、 前列腺癌和宫颈癌等肿瘤中表达上调3, 这些microRNAs的靶基因有肿瘤抑制基因RB1(Retinoblastoma 1)和TGFBR2

11、(transforming growth factor, beta receptor II); miR20a可以通过与E2F2 and E2F3的3端非翻译区域的结合来调控它们的转录翻译, miR20a的过表达可以减少前列腺癌细胞的凋亡4; miR175p和miR20a的反义寡核苷酸可以诱导肺癌细胞的凋亡5; miR106a和miR20b在T白血病细胞中累积6; 早幼粒细胞白血病中可见let7d和miR342的表达上调7; miR26在人膀胱癌中高表达8。以上研究证实microRNAs通过调控靶基因参与肿瘤细胞增殖和细胞凋亡, 而我们检测到在SLE患者外周血淋巴细胞中也有这些microRNAs

12、的高表达, 提示它们也可以通过调节靶基因的表达而参与SLE的发病。 SLE患者中低表达的人类来源的microRNAs有miR370和miR379。miR379的功能及其靶基因尚不清楚。最新研究报道miR370的一个靶基因是有丝分裂活性蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase kinase kinase 8, MAP3K8), MAP3K8是癌症转化蛋白, 可以激活MAPK, SAPK和NFB信号通路。研究表明IL6的过表达可以降低miR370的表达, 而使miR370的靶基因MAP3K8表达上调, 促进胆管细胞肿瘤的发生。因此我们推测 miR370的低表达也有

13、可能使其靶基因上调, 激活一些信号通路, 诱导淋巴细胞过度增殖及细胞因子的释放从而导致SLE的发生及发展。 我们的结果揭示在SLE患者外周血单个核细胞中存在着与肿瘤相似的microRNAs异常表达谱, 说明microRNAs也通过调控其靶基因的转录参与SLE的发病过程。【参考文献】 1 Calin GA, Ferracin M, Cimmino A, et al. A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemiaJ. N Engl J Med, 2005,

14、 353(17): 1793-1801.2 Lu J, Getz G, Miska EA, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancersJ. Nature, 2005, 435(7043): 834-838.3 Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targetsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(7):

15、2257-2261. 4 Sylvestre Y, De Guire V, Querido E, et al. An E2F/miR20a autoregulatory feedback loopJ. J Biol Chem, 2007, 282(4): 2135-2143.5 Matsubara H, Takeuchi T, Nishikawa E, et al. Apoptosis induction by antisense oligonucleotides against miR175p and miR20a in lung cancers overexpressing miR1792J. Oncogene, 2007, 26(41): 6099-6105.6 Landais S, Landry S, Legault P, et al. Oncogenic potential of the miR106363 cluster and its implication in human Tcell leukemiaJ. Cancer Res, 2007, 67(12): 5699-5707.7 Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, et al. MicroRNA gene expression d