高效液相色谱操作基础知识拓展

1、高效液相色谱知识高效液相色谱知识 一、液相色谱的原理 二、HPLC的特点 三、HPLC 的组成 四、流动相 五、缓冲溶液的作用 六、梯度洗脱的流动相调整 七、遇到问题的解决 八、气相与液相的区别上海波粒仪器科技有限公司友情供一、液相色谱的原理 原理原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出 。( (反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来) 正相

2、色谱正相色谱：流动相使用非极性的疏水性溶剂（流动相极性固定相极性），常用于分离中等极性或极性较强的化合物（如酚类、胺类、酸基类及氨基类）;流出峰顺序为极性小的先流出。 反相色谱反相色谱：流动相极性固定相极性；流出峰顺序为极性大的先流出上海波粒仪器科技有限公司友情供二、HPLC的特点 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是

3、高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 上海波粒仪器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的组成 HPLC系统一般由高压输液泵、进样器、OL Apple系列色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成 。 一、高压输液系统 1、泵的性能流量稳定，其RSD应0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；流量范围宽，分析型应在0.110 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；输出压力高，一般应能达到150300 kg/cm2

4、；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。 2、梯度洗脱 上海波粒仪器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的组成 HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意

5、程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：上海波粒仪器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的组成 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富

6、集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让1030倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡上海波粒仪器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的组成 二、进样器 HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样 （我

7、们是自动进样器） 注意事项：样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤；为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。 三、色谱柱实验室所用为OLC18柱（注：C18柱对PH要求比较严格，PH28之间。）上海波粒仪器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的组成在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护OL色谱柱。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。应逐渐改

8、变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂

9、质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。上海波粒仪器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的组成 四、检测器通用型紫外检测器 UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度（实际是提高检测限）。此外，梯度洗脱

10、时，还会产生漂移。 注：将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A1时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。上海波粒仪器科技有限公司友情供四、流动相流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干

11、扰组分的吸收测量。（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50IOOnm。上海波粒仪器科技有限公司友情供四、流动相流动相 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 (5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.上海波粒仪器科技有限公司友情供四、流动相流动相流动相类别按流动相组成分：单组份和多组份按极性分：极性、弱极性、非极性按使用方法分：等度洗

12、脱和梯度洗脱二、流动相的选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择流动相的重要依据。（注：改变流动相的组成、极性是改善分离的最重要的直接因素）常用溶剂的极性顺序：水甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环THF甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油 最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 上海波粒仪器科技有限公司友情供五、缓冲溶液的作用 在反相色谱中，流动相的在反相色谱中，流动相的PHPH值一般为值一般为2-82-8，当被分析物在反，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的相条件下可离解，或样品的PHPH值在值在2-82-8之外时，就需

13、要缓冲之外时，就需要缓冲溶液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基或羧基，溶液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基或羧基，它们的它们的PKaPKa在在1-111-11之间，选择正确的缓冲液之间，选择正确的缓冲液PHPH值可保证可离值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物形式，解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物形式，如果样品的如果样品的PHPH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可以使其变温值对柱子有伤害，则缓冲溶液可以使其变温和从而减小危害。和从而减小危害。 在选择缓冲溶液的在选择缓冲溶液的PHPH值时，应先了解被测物的值时，应先了解被测物的PKaPKa，高于或，高于

14、或低于低于PKa2PKa2个个PHPH单位的，有助于获得好的、尖锐的峰。从以单位的，有助于获得好的、尖锐的峰。从以下公式可知。下公式可知。 PH=PKa+logPH=PKa+log（AA- -/A/A）溶液的溶液的PHPH值高于或低于值高于或低于PKa2PKa2个单位，化合物中个单位，化合物中99%99%以一种形式以一种形式存在，而以一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐峰。存在，而以一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐峰。上海波粒仪器科技有限公司友情供六、梯度洗脱的流动相调整1、由强到弱，一般先用90%甲醇（乙腈）/水（或缓冲溶液）试验，这样可以很快得到分离效果，然后调整有机溶剂的比例。、三倍

15、规则：每减少10%的有机溶剂的量，容量因子增加三倍，调整过程中注意各峰的分离情况。、粗调转细调：当分离到一定程度，应将10%有机溶剂改为5%，并依此规则逐渐降低调节量，直至各组分分离情况不改变。上海波粒仪器科技有限公司友情供六、梯度洗脱的流动相调整1、相同条件下不同的配比分离效果好下：60/4050/5040/60上海波粒仪器科技有限公司友情供上海波粒仪器科技有限公司友情供七、样品的测定 1、如果拿到一个样品时，首先考虑是否适合液相来分析，一般适合液相分析的样品通常具有这样的性质，在190-900nm之间有吸收（根据检测器而定），性质稳定，不与流动相发生反应，沸点较高均，能够用色谱柱（正反相）

16、分离； 2、样品前处理 样品能否溶于流动相 用反相柱子分析的，注意浓度不能太高 配制后样品如有杂质，则需进行过滤 3、流动相的调整 4、做完后对仪器进行冲洗。上海波粒仪器科技有限公司友情供八、遇到问题的解决1、溶剂量不够色谱柱会进入空气吗？答：不会的。因为泵只会输送液体，不能输送气体，所以不用担心柱子里会充满气体而损坏柱子。2、液相色谱中紫外检测器对温度的要求高吗？答：紫外检测器对温度变化不太敏感。3、基线突然提高，变粗，处理方法：检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。线噪音变大：未接地线，可在检测器的外壳外接一根铁丝连地； 灯能量不足，可在funk功能中查找灯的使用时间，或拆开机器外

17、壳，观看紫外灯的强度； 检测池污染，拆下柱子，用无体积连接器连接泵和检测器，用异丙醇小流速冲洗半个小时即可； 流动相污染或进气泡。4 、有时会出现样品方法已建立，序列也已编好，就是运行不了，什么原因？上海波粒仪器科技有限公司友情供九、气相与液相的区别1、 GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合力LC：流动相为液体2、 GC：样品需加热气化或裂解；LC：样品制成溶液即可3、 GC：加温操作；LC：通常室温操作，高压泵操作4、 GC：通用型检测器TCD，MSD，选择性检测器FID，ECD，FPD，NPDLC：通用型检测器RID，ELSD，MSD，选择性检测器UVD，PDAD，FD，ECD5、 GC：分析低分子量、低沸点有机化合物和永久性气体；配合程序升温分析高沸点有机化合物；配合裂解技术分析高聚物；不能检测挥发性差、热稳定性差和离子型样品；占有机物的20%。LC：既可分析低分子量、低沸点有机化合物；也可分析中、高分子量和高沸点有机化合物；对于热不稳定、难挥发、有生物活性及离子型化合物均可检测；占有机物的80%