酶工程实验小麦萌发前后淀粉酶活力的

1、实验六实验六 小麦萌发前后淀粉小麦萌发前后淀粉酶活力的比较酶活力的比较一、实验目的一、实验目的n1. 学习提取淀粉酶的方法。学习提取淀粉酶的方法。n2. 学习测定淀粉酶活力的方法。学习测定淀粉酶活力的方法。n3. 了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。二、实验原理二、实验原理n淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成麦芽糖、葡萄糖等小分子物质而被机作用后生成麦芽糖、葡萄糖等小分子物质而被机体利用。体利用。n淀粉酶主要包括淀粉酶主要

2、包括-淀粉酶淀粉酶和和-淀粉酶淀粉酶两种。两种。-淀淀粉酶可随机地作用于淀粉中的粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。n淀粉的水解产物麦芽糖有还原性能与淀粉的水解产物麦芽糖有还原性能与3，5-二硝基二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色水杨酸试剂反应，使其还原

3、生成红色3-氨基氨基-5-硝硝基水杨酸。基水杨酸。n在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。力。 n休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。本实验观察加。本实验观察小麦

4、种子萌发前后淀粉酶活力小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。的变化。三、试剂三、试剂 n1. 0.1标准麦芽糖溶液标准麦芽糖溶液 ：精确称量：精确称量100毫毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量容量瓶中，加蒸馏水至刻度。瓶中，加蒸馏水至刻度。n2pH 6.9，0.02molL磷酸缓冲液磷酸缓冲液 100毫毫升升n31淀粉溶液：淀粉溶液：1克可溶性淀粉溶于克可溶性淀粉溶于100毫毫升升 0.02molL磷酸缓冲液，其中含有磷酸缓冲液，其中含有 0.006molL氯化钠氯化钠。n413,5-二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂: 1g 3,5-二硝基水杨酸溶于二硝基

5、水杨酸溶于20毫升毫升2摩尔摩尔L的氢的氢氧化钠溶液和氧化钠溶液和50毫升水中；再加人毫升水中；再加人30克克酒石酸钾钠，定容至酒石酸钾钠，定容至100毫升。若溶液毫升。若溶液混浊，可过滤。混浊，可过滤。n51氯化钠氯化钠n6石英砂石英砂四、操作步骤四、操作步骤n1 1种子发芽：种子发芽：n小麦种子浸泡小麦种子浸泡2.5 h后，放人后，放人25恒温箱内或恒温箱内或在室温下发芽。在室温下发芽。n 2 2 酶液提取：酶液提取：n 取发芽第取发芽第3-4天的幼苗天的幼苗15株，放人乳钵内，株，放人乳钵内，加适量石英砂加适量石英砂(200mg)，加，加 1氯化钠溶液氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温

6、下放置毫升，用力磨碎。在室温下放置 20分钟，分钟，搅拌几次。将提取液离心（搅拌几次。将提取液离心（3000转转min）10分钟。分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积总体积V。进行酶活力测定时，进行酶活力测定时，将酶提取液用将酶提取液用Ph6.9的磷酸缓冲液稀释的磷酸缓冲液稀释10倍。倍。n取干燥种子取干燥种子15粒作为对照（提取步骤同上）。粒作为对照（提取步骤同上）。n3 3酶活力测定：酶活力测定：n （1）取）取25毫升刻度试管毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须（各试剂须25预热预热10分钟）。分钟）

7、。1（干种子）（干种子）2（湿种子）（湿种子）3（标准管）（标准管） 4（空白管）（空白管）酶液酶液0.50.5-标准麦芽标准麦芽糖溶液糖溶液-0.5-淀粉溶液淀粉溶液1111蒸馏水蒸馏水-0.5n将各管混匀，放在将各管混匀，放在25，水浴中保温，水浴中保温3分钟后，分钟后，立即向各管中加人立即向各管中加人1 3，5-二二硝基水杨酸溶液硝基水杨酸溶液2毫升毫升。n（2）取出各试管，放人沸水浴中加热）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。毫升。将各管充分混匀。将各管充分混匀。n（3）用空白管作对照；在）用空白管作对照；在500nm处测处测定各管的光吸收值，记录结果。定各管的光吸收值，记录结果。n4 4计计 算算n本实验规定：本实验规定：25时时3min3min内水解淀粉释放内水解淀粉释放1mg1mg麦芽糖麦芽糖所需的酶量为所需的酶量为1 1个酶活力单位（个酶活力单位（U U）。）。n根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准标准A未知未知C标准标准C未知未知nC（酶液管浓度）（酶液管浓度）A酶酶C标准标准A标准标准n则则15粒种子或幼苗的总活力单位粒种子或幼苗的总活力单位= C酶酶N酶酶V酶酶nN为酶液的稀释倍数为酶液的稀释倍数nV为提取酶液的总体积为提取酶液的总体积思考题思考