酶工程-05电泳

1、电泳技术n1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。n2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好n3 电泳方法分类 按电场分：常压（500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式n4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）一 电泳的基本原理n电泳分离：n移动方向：带电性质决定n泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vtn影响的因素：n1颗粒本身：带电、大小、形状n2 外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。二 纸电泳n以滤纸为支

2、持体的电泳技术n操作要点：n1 选择缓冲液n对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响nA 分离蛋白质，pI 5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)nB 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸醋酸，pH5.9nC 分离核苷酸巴比妥醋酸pH2.5，柠檬酸pH23nD 分离糖类：HAC-NaAC, pH35n2 滤纸的选择与处理n层析用滤纸，纸宽23cm/样品组分，长短影响电场强度。n3 点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品） 干法、湿法n4 电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间n5 显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10

3、B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察n一般洗脱定量三 薄膜电泳n支持体：薄膜n优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存n广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析n操作n1 薄膜的处理与放置n2 点样 平衡n3 电泳：E 1025V/cm，0.52hn4 显色四 薄层电泳n将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。n常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等n操作：n1 缓冲液选择n离子强度较高的缓冲液n2 支持物处理n精制品n3 薄层板制作n4加样：挖沟、混合样品、填埋n5 电泳n6分析：印染法五 凝胶电泳n支持物：多孔凝胶n聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等n具

4、有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高n最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：n机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。n分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；n连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳n1 聚丙烯酰胺凝胶的制备n丙稀酰胺（单体）N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）（催化剂） 聚合n催化剂：n（1）过硫酸铵四甲基乙二胺（TEMED）n（2）核黄素（VitB2）光n改变单体浓度可改变凝胶孔径n交联剂对孔径有影响：5最小n根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。n2 不连续电泳中样品压缩成层的原理n不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液：n样品

5、胶：大孔径，pH6.76.8Tris-HCl缓冲液n浓缩胶：与样品胶相同n分离胶：小孔径，pH8.88.9 Tris-HCl缓冲液n样品压缩成层原理：n电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸nHCl (解离） Cl ， Cl 泳动速度最快（快离子）nCH2(NH2)COOH (样品胶、浓缩胶pH6.76.8） CH2(NH2)COO（0.11.0）泳动速度最慢（慢离子）n蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间n电泳时， Cl 超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区较高电位梯度P和慢离子加速移动P压缩成层n样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测）， CH2(NH2)COO增加，

6、泳动速度增大，很快超过P， P在均一的电位梯度和pH条件下分离SDS-凝胶电泳原理n聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。n加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。n分离测定：n测分子量（与标准蛋白比较）n鉴定样品纯度（条带数目）n测定样品P含量：扫描定量（比色）凝胶电泳的操作要点n1 凝胶制备n2 电极缓冲液n3 样品处理及加样n4 电泳n5 染色与固定n6 脱色n7 分析烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯

7、化六 等电点聚焦电泳n电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。n优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。n缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的P。n1 稳定的稳定的pH梯度的形成梯度的形成n2 两性电解质载体 要求： 由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH范围的商品两性电解质载体）n3 支持pH梯度的介质 密度梯度溶液（用于自由电泳） 凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）n4 操作要点 pH梯度支持介质的制备

8、 聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成梯度凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为5，底部凝胶浓度为25。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。梯度凝胶电泳也通常加入SDS，并有浓缩胶。电泳过程与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。与单一浓度的凝胶相比，梯度凝胶有几个优点： 梯度凝胶电泳首先，梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。单一凝胶电泳

9、对于分子量超过其分离范围的蛋白质，过大或过小，都不能分离。而梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大，分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离，而分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离，所以分子量较大和较小的蛋白质可以同时得到分离。例如用430的梯度胶可以分离分子量5万200万的蛋白质。 另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。电泳过程中，蛋白质在梯度凝胶中迁移，经过的孔径越来越小，直到凝胶的孔径不能通透，这样电泳过程中蛋白质就被浓缩，集中在一个很窄的区带中。而分子量略小的蛋白质可以迁移得更靠前一些，被集中在略前面的区带中。由于梯度凝胶孔径逐步变

10、小，在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分离。 可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基，因此这一方法可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互为补充。梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量，而对纤维蛋白将产生较大的误差。由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白质分子到达完全被阻止迁移的孔径时才能成立，因此电泳时要使用较高的电压，例如平板凝胶为0.5mm厚，使用600V电压， 50mA电流，电泳时间约需2小时。电泳技术思考题n