Promocell原代细胞培养

1、经验分享经验分享原代细胞和干细胞原代细胞和干细胞培养中可能出现的问题培养中可能出现的问题PromoCell Academy 3/3/2022CytokinesAntibodiesELISAsCell AssaysTransfection Reagents Human CellsOptimized MediaClassical MediaSeraCell Culture ReagentsCell CultureCell BiologyTraining CoursesThree PromoCell BrandsCell CultureMolecular BiologyQuality Managem

2、entPromoCell Academy 3/3/20221990年开始科学家指年开始科学家指导导科学家科学家用用“ “技技术术” ”取代取代“ “经验经验” ”用用“ “经验经验” ”取代取代“ “运气运气” ”PromoCell Academy 3/3/2022细胞培养中产生问题的可能原因细胞培养中产生问题的可能原因PromoCell Academy 3/3/2022微生物污染微生物污染 (I)(I)细菌污染细菌污染 培养基浑浊 培养基变黄（pH值改变） 显微镜下：移动的黑点或杆状物 大小：1-5m 来源：操作人员/水浴不能再进一步培养不能再进一步培养 丢弃丢弃! !PromoCell A

3、cademy 3/3/2022真菌污染真菌污染 培养基变黄（pH值改变） 生长相对缓慢 来源：气流 显微镜下：u 菌丝体主要是植物式的生长模式u分枝菌丝菌丝体，孢子生产能力强不要打开培养容器，不要打开培养容器，直接丢弃直接丢弃！微生物污染微生物污染 (II)(II)PromoCell Academy 3/3/2022酵母菌污染酵母菌污染 培养基呈云雾状 椭圆形，酵母细胞芽接，成链 大约3-5m 来源：气流 可以用抗真菌药剂清除（如两性霉素可以用抗真菌药剂清除（如两性霉素B B和制霉菌素）和制霉菌素）微生物污染微生物污染 (III)(III)PromoCell Academy 3/3/2022支

4、原体污染支原体污染 首次发现于首次发现于18981898年，被定义为病毒年，被定义为病毒 是已知的能自我复制的最小原核生物是已知的能自我复制的最小原核生物 直径为0.2-0.8m能够通过孔径为0.45m的纤维素和聚乙烯醇过滤器（由于其变形的能力，甚至能够穿过0.22m宽的孔径！） 缺乏细胞壁肽聚糖耐青霉素 一般在培养中无明显的表象（肉眼不可见，显微镜下也不可见 一般发生在胞外，只有极少数几率发生在胞内一般发生在胞外，只有极少数几率发生在胞内微生物污染微生物污染 (IV)(IV)PromoCell Academy 3/3/2022微生物污染微生物污染 (IV)(IV) HK-2细胞 (人肾近曲小

5、管上皮细胞) 复苏后细胞第一天贴壁，但细胞中可见空泡样改变 然后传代后出现明显生长迟缓 空泡增加，继而细胞崩解 培养基是DMEM/F12：10%FBS 冻存液是90%FBS+10%DMSOPromoCell Academy 3/3/2022支原体污染后的表现和支原体污染后的表现和肉眼可见肉眼可见特征特征 即使细胞培养过程中支原体的浓度达到非常高的水平（大于108个支原体/ml），仍然没有任何明显可见的污染征兆 培养基的颜色提前变化（pH值转变） 倍增时间延长 细胞形态改变 细胞表层穿孔 细胞周边不均匀 空泡形成 细胞结构降解PromoCell Academy 3/3/2022 对生长速度的不利

6、影响 支原体能够与细胞竞争营养物质，并分泌有害的代谢产物，从而对细胞增殖能有50%的抑制作用（有这篇文献为证McGarrity et al., 1984） 葡萄糖快速降低，形成酸pH值转变 精氨酸耗尽抑制蛋白质的生物合成，细胞分裂和细胞生长 引起染色体畸变和多种易位（McGarrity et al., 1978） 基因芯片和基因表达谱产生显著的变化 支原体能够占总蛋白的50%和纯化总DNA的15-30%他们甚至能够基本上控制宿主细胞所有的代谢功能在细胞培养中出现支原体污染以后的后果在细胞培养中出现支原体污染以后的后果PromoCell Academy 3/3/2022 对生长速度的不利影响 支

7、原体能够与细胞竞争营养物质，并分泌有害的代谢产物，从而对细胞增殖能有50%的抑制作用（有这篇文献为证McGarrity et al., 1984） 葡萄糖快速降低，形成酸pH值转变 精氨酸耗尽抑制蛋白质的生物合成，细胞分裂和细胞生长 引起染色体畸变和多种易位（McGarrity et al., 1978） 基因芯片和基因表达谱产生显著的变化 支原体能够占总蛋白的50%和纯化总DNA的15-30%他们甚至能够基本上控制宿主细胞所有的代谢功能因此要因此要进进行支原体行支原体检测检测以便以便验证验证支原体的存在支原体的存在在细胞培养中出现支原体污染以后的后果在细胞培养中出现支原体污染以后的后果Pro

8、moCell Academy 3/3/2022支原体的检测支原体的检测 DNA荧光染色（Bisbenzimid, DAPI）（图例） PCR技术（图例） 一般以下情况需要进行支原体检测：一般以下情况需要进行支原体检测： 新型的细胞和病毒培养物 持续培养的细胞系每月进行检测；对实验室污染的情况下每周进行检测 在每次液氮再次冻存之前 对细胞特征进行改造修饰之后 在无法得到重复的实验结果的情况下 实验员察觉到了显著的支原体污染时！PromoCell Academy 3/3/2022支原体的检测支原体的检测 DNA荧光染色（Bisbenzimid, DAPI）（图例） PCR技术（图例）（特异的引物设

9、计来自高度保守的核糖体 RNAs/16S-rRNA的DNA编码序列。 在支原体中，保守的rRNA基因序列非常类似。 这些引物不会检测到细菌或者动物的DNA序列） 一般以下情况需要进行支原体检测：一般以下情况需要进行支原体检测： 新型的细胞和病毒培养物 持续培养的细胞系每月进行检测；对实验室污染的情况下每周进行检测 在每次液氮再次冻存之前 对细胞特征进行改造修饰之后 在无法得到重复的实验结果的情况下 实验员察觉到了显著的支原体污染时！PromoCell Academy 3/3/2022被污染的细胞培养物或者病毒储液的处理被污染的细胞培养物或者病毒储液的处理 立即隔离培养物（培养箱），并检测相应的

10、冻存细胞样品 通知所有相关人员 对实验室进行标准消毒 对无法替代的，珍贵的细胞立即实施抢救 高压灭菌/丢弃那些可以替代的细胞PromoCell Academy 3/3/2022支原体清除的方法支原体清除的方法 抗生素抗生素氟喹诺酮类衍生物环丙沙星 (例如PromoKine的产品BIOMYC-3)支原体去除试剂（MRA）四环素类BIOMYC-1 和2 (PromoKine) (Tiamutin and Minocyclin) 一些能够有效消除支原体的特殊特殊试剂试剂 Mycoplasma-EX (PromoKine) (抗生素/非抗生素联合使用)PromoCell Academy 3/3/202

11、2污染污染来来源源 新鲜分离的原代细胞（人类或者动物组织） 与已受污染培养物的交叉污染 来自未知源头的新培养物，甚至有些来自细胞银行（例如ATCC） 病毒悬浮液，抗体溶液或者其他已污染培养基中加过的添加剂 直接污染 血清（只使用检测过的血清，例如无微生物和支原体的） 被污染培养物接触涉及的实验室仪器，培养基和试剂（CO2培养箱，细胞培养工程师，细胞，培养瓶/皿，通风橱，塑料器皿，培养基，试剂等） 系统地复核污染源的来源！系统地复核污染源的来源！PromoCell Academy 3/3/2022细胞培养中出现污染的其他原因细胞培养中出现污染的其他原因PromoCell Academy 3/3/

12、2022良好的细胞培养规范良好的细胞培养规范 (GCCP)(GCCP)开始开始实验实验之前之前： 消毒超净工作台表面消毒手/手套，尤其是大拇指及指缝（容易被忽视）在开始实验前，将所有材料和仪器（培养基瓶子，移液管盒，移液辅助用品）放进超净工作台里面，在使用之前对所有物品进行消毒。用70%的酒精消毒仪器表面不需立即擦干或吹干，否则没有足够的作用时间起到消毒效果。检查以确保细胞没有被污染。被污染的细胞需立即丢弃，不能再打开培养瓶，防止对其他实验者造成交叉污染。PromoCell Academy 3/3/2022实验中实验中： 不要在敞开的瓶子或者培养皿上方操作在超净工作区域里面或者靠近超净工作区域

13、的动作不要太快否则将会阻碍超净工作区域内的正常气流循环在实验中不要触摸超净工作区域外的任何东西（特别是自己的脸和头发）以免污染乳胶手套如果乳胶手套被污染了，那么在继续操作之前需要重新对其进行消毒不要把没有用的仪器堆在通风罩里面从而阻断气流将所有溢出或溅出的液体擦去讲话，打喷嚏或者咳嗽请远离超净工作区域，以免干扰气流/引入污染良好的细胞培养规范良好的细胞培养规范 (GCCP)(GCCP)PromoCell Academy 3/3/2022实验结实验结束以后束以后： 从超净工作台中取出仪器和材料之前，都需要进行消毒 消毒超净工作台的台面 根据生产厂商的说明书定期选用合适的消毒剂对超净工作台表面进行

14、消毒 定期使用生产厂商的超净工作台的层流罩维护服务 （并记录紫外灯的“失效”情况），这一点非常重要良好的细胞培养规范良好的细胞培养规范 (GCCP)(GCCP)PromoCell Academy 3/3/2022消极影响消极影响： 有毒性，抑制增殖 对几种细胞的分化有负面的影响（例如血液祖细胞） 会导致原代细胞的增值速率降低（抑制率高达40%）（参考文献：The prophylactic use of antibiotics in cell culture, Ingrid Kuhlmann 1996） 会影响基因/蛋白的表达 会导致耐药性抗生素的使用与否？抗生素的使用与否？PromoCell

15、Academy 3/3/2022 预防性地使用抗生素会使得操作人员忽视细胞培养中的无菌操作规范从而导致无菌条件的破坏 抗生素在37oC时只能维持短暂的稳定（耐热性能；Pen/Strep: 3天) 只有在完全确定需要时才使用抗生素： 从组织中分离原代细胞 非常珍贵和无法替代的细胞系 在诱导型的启动子系统中 可能的话：尽量在没有抗生素的情况下可能的话：尽量在没有抗生素的情况下进行进行标准操作标准操作抗生素的使用与否？抗生素的使用与否？PromoCell Academy 3/3/2022细胞培养中的常规步骤细胞培养中的常规步骤 细胞的解冻 培养基更换 传代（细胞的“分裂”/细胞的“传代”）Promo

16、Cell Academy 3/3/2022目标目标：保留尽可能多的健康有增殖能力的细胞能存活然而：然而：解冻的操作过程对细胞压力很大 冻存液中包含DMSO作为抗冻保护剂 液体的DMSO（在解冻过程中）对细胞是有毒的：DMSO的最终浓度不能超过1%（细胞在该种情况下能耐受16-24h）因此必须因此必须： 在37oC的环境下尽快解冻细胞 在把细胞取出液氮罐之前，尽量准备好所有的东西 解冻后尽快稀释DMSO冻存细胞的解冻冻存细胞的解冻要点要点PromoCell Academy 3/3/2022解冻细胞解冻细胞步骤步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶PromoCell Academy 3/3/2022解

17、冻细胞解冻细胞步骤步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养箱中预热约30分钟PromoCell Academy 3/3/2022解冻细胞解冻细胞步骤步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养基中预热约30分钟 将冻存管从液氮罐中取出（总在干冰或者液氮中运输），开/关盖子PromoCell Academy 3/3/2022解冻细胞解冻细胞步骤步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养基中预热约30分钟 将冻存管从液氮罐中取出（总在干冰或者液氮中运输），开/关盖子 在37C水浴中放置约90秒，解冻细胞PromoCell Academy 3/3/2022解冻细胞解冻细胞步骤步骤

18、准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养基中预热约30分钟 将冻存管从液氮罐中取出（总在干冰或者液氮中运输），开/关盖子 在37C水浴中放置约90秒，解冻细胞 消毒冻存管，将其中的细胞立即转移到预热的培养基中PromoCell Academy 3/3/2022解冻细胞解冻细胞步骤步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养基中预热约30分钟 将冻存管从液氮罐中取出（总在干冰或者液氮中运输），开/关盖子 在37C水浴中放置约90秒，解冻细胞 消毒冻存管，将其中的细胞立即转移到预热的培养基中 在CO2培养箱（37C, 5% CO2）中放置大约16-24 hPromoCell Academy

19、3/3/2022细胞培养中故障的其他原因细胞培养中故障的其他原因PromoCell Academy 3/3/2022CO2 培养箱培养箱参数参数：* 温度* CO2 浓度* 相对湿度 能维持细胞的生理条件能维持细胞的生理条件然而：然而： * 这也是酵母菌，真菌和细菌的最佳生长环境！ * 频繁的开门会导致温度、CO2浓度和湿度的偏差PromoCell Academy 3/3/2022细胞培养中故障的其他原因细胞培养中故障的其他原因PromoCell Academy 3/3/2022更换培养基更换培养基培养基更换的频率和传代的间隔取决于特定细胞类型的生长速率一般来说，原代细胞培养中的培养基需每2-

20、4天更换一次： 周一周一 周三周三 周五周五 (快生长的细胞培养) 周一周一 周四周四 周一周一 (慢生长的细胞培养)培养基更换太勤或太少都有消极的影响： 生长停滞 细胞死亡PromoCell Academy 3/3/2022用用Melanocyte Growth Medium M2 培养的培养的NHEM M2 (10 x)2 2天不换培养基天不换培养基培养基更换太少时的细胞形态培养基更换太少时的细胞形态1 1周不换培养基周不换培养基 2 2周不换培养基周不换培养基PromoCell Academy 3/3/2022培养基中的血清培养基中的血清血清是传统培养基配方中最不确定的成分！批次间差异极

21、大（生长因子，激素，蛋白质）建议建议： 对不同的批次进行预实验，购买并预留能在您的实验中发挥良好功能的批次（1-3年） 如果可能的话，使用血清含量较低或者无血清的培养基 如果没有必要，不要使用“热灭活”的血清对血清加热 (30 min, 56C) 的目的是为了灭活补体保存和解冻保存和解冻： 保存：在4 C可以放置6-8周；-20 C 可保存3-5年 解冻：在室温或4oC冰箱中最理想，随放在37C (水浴)。频繁地晃动以便分散释放出来的无机盐和蛋白质（避免局部盐浓度过高，避免血清温度过高） 避免血清的反复冻/融，以免产生沉淀PromoCell Academy 3/3/2022血清的使用会导致细胞

22、形态不可逆的改变血清的使用会导致细胞形态不可逆的改变气道上皮细胞生长培养基气道上皮细胞生长培养基 ( (无血清无血清) )Bronchial Epithelial Cells (HBEpC, 10 x)在在DMEM + 10%DMEM + 10%血清中培养血清中培养2 2天天PromoCell Academy 3/3/2022人类成骨细胞人类成骨细胞 贴壁的原代细胞必须在密度达到70-90%的时候传代如果细胞长得太密会导致接触抑制、生长停滞贴壁细胞的传代培养一般原则贴壁细胞的传代培养一般原则PromoCell Academy 3/3/2022预热脱壁试剂贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程Pr

23、omoCell Academy 3/3/2022预热脱壁试剂吸走贴壁细胞表面的生长培养基贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022预热脱壁试剂吸走贴壁细胞表面的生长培养基在室温下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗细胞单层贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022预热脱壁试剂吸走贴壁细胞表面的生长培养基在室温下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗细胞单层吸走清洗溶液贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022预热脱壁试剂

24、吸走贴壁细胞表面的生长培养基在室温下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗细胞单层吸走清洗溶液加入胰酶/EDTA（0.04% / 0.03%）贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022预热脱壁试剂吸走贴壁细胞表面的生长培养基在室温下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗细胞单层吸走清洗溶液加入胰酶/EDTA（0.04% / 0.03%）在显微镜下观察脱壁过程（细胞形态逐渐变圆） 胰酶的浓度和的孵育作用时间取决于细胞的类型和细胞的生长密度贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3

25、/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用上下吹吸以重悬细胞，将上清液转移到一个离心管中贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用上下吹吸以重悬细胞，将上清液转移到一个离心管中在220g的重力加速度下离心3-5分钟贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022用胰酶中止溶液或者含1

26、0%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用上下吹吸以重悬细胞，将上清液转移到一个离心管中在220g的重力加速度下离心3-5分钟去除澄清的上清液，将沉淀下来的细胞团用新鲜的培养基重悬贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用上下吹吸以重悬细胞，将上清液转移到一个离心管中在220g的重力加速度下离心3-5分钟去除澄清的上清液，将沉淀下来的细胞团用新鲜的培养基重悬计数细胞，将细胞以合适的接种密度接种到一个新的培养瓶中贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022

27、用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用上下吹吸以重悬细胞，将上清液转移到一个离心管中在220g的重力加速度下离心3-5分钟去除澄清的上清液，将沉淀下来的细胞团用新鲜的培养基重悬计数细胞，将细胞以合适的接种密度接种到一个新的培养瓶中在37C的CO2培养箱中孵育贴壁细胞的传代过程贴壁细胞的传代过程PromoCell Academy 3/3/2022代数代数 PromoCell不用代数来计算细胞的年龄而使用倍增数（PD） passage 一词只是描述了脱壁和重新接种的过程而不能体现细胞培养中真正的繁衍衰老过程，因为传代操作的时间点是有弹性的： 分裂比率可能不同 传代可能在不同的细胞密度阶段 如果你实在想用Passage 这一术语尽量使您的操作过程标准化以保持相似性 在一周中的同一天分离细胞 每一个培养瓶中接种相同量的细胞 在每一周的相同时间更换培养基PromoCell Academy 3/3/2022细胞在培养中的衰老细胞在培养中的衰老人类肺动脉平滑肌细胞人类肺动脉平滑肌细胞 (HPASMC) (HPASMC)培养后培养后3 3天天培养后培养后2424天天10 x10 xPromoCell Academy 3/3/2022其他补充和总结其他补充和总