成果2y集学位答辩

1、肿瘤相关抗原及其抗体抑瘤作用的研究答辩人：冯 静导 师：阎锡蕴 研究员2005. 7.25.2005. 7.25.2005. 7.25.博士论文答辩可变区互补决定区恒定区Fc抗体对靶细胞的作用机制靶向作用靶向作用中和作用中和作用封闭作用封闭作用治疗性抗体的发展抗体理化性质、抗体理化性质、结构、功能结构、功能1896年1975年1984年基因工程抗体基因工程抗体1990年全人抗体全人抗体1960年1980年抗体多样性的抗体多样性的遗传学基础遗传学基础Porter & Edelman TonegawaMilstein & KohlerVon Behring多价抗血清多价抗血清单克隆

2、抗体单克隆抗体 抗体名称抗体名称抗体类型抗体类型肿瘤抗原肿瘤抗原适应症适应症认证时间认证时间Edrecolomab(Panorex) 小鼠抗体小鼠抗体 Ep-CAM 结直肠癌结直肠癌1995年Rituximab(Rituxan)嵌合抗体嵌合抗体CD20非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤1997年Trastuzumab(Herceptin)人源化抗体人源化抗体HER2/NEU (ERBB2)乳腺癌乳腺癌1998年Gemtuzumab ozogamicin(Mylotarg)人源化抗体人源化抗体-calicheamicinCD33急性骨髓性白血病急性骨髓性白血病2000年Alemtuzumab(Ca

3、mpath)人源化抗体人源化抗体CD52B B细胞慢性淋巴细细胞慢性淋巴细胞白血病胞白血病2001年Ibritumomab tiuxetan (Zevalin) 90Y-小鼠抗体小鼠抗体CD20非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤2002年Tositumomab(Bexxar) 131I-小鼠抗体小鼠抗体CD20非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤2003年Cetuximab(Erbitux) 嵌合抗体嵌合抗体EGFR结直肠癌、头颈部结直肠癌、头颈部癌、非小细胞肺癌癌、非小细胞肺癌2004年Bevacizumab(Avastin) 人源化抗体人源化抗体VEGF结直肠癌结直肠癌2004年已上市肿瘤治疗性

4、抗体一览已上市肿瘤治疗性抗体一览 肿瘤诊断肿瘤标志物抗体靶向治疗肿瘤抗原正常细胞肿瘤细胞寻找合适的靶抗原是发展肿瘤免疫诊断和治疗的关键环节！肿瘤抗原肿瘤抗体肿瘤诊断肿瘤治疗研究目的基因图谱分析技术基因图谱分析技术正常细胞肿瘤细胞差异展示消减杂交局限：局限：1.以重组表达的蛋白做抗原无法保证抗原的天然构象；以重组表达的蛋白做抗原无法保证抗原的天然构象；2.基因水平的差异无法显示蛋白翻译后修饰的差异。基因水平的差异无法显示蛋白翻译后修饰的差异。抗体差异筛选抗体差异筛选创新点：创新点：1.以肿瘤抗原的天然形式作为抗原，保持抗原的以肿瘤抗原的天然形式作为抗原，保持抗原的天然构象；天然构象；2.涵盖基因

5、水平及蛋白水平的差异；涵盖基因水平及蛋白水平的差异；3.抗体抗体 抗原。抗原。LS174T细胞裂解物LS174T活细胞LS174TELISA抗体差异筛选抗体差异筛选CC4T2-2第一部分单克隆抗体CC4的抗肿瘤作用抗体差异筛选显示CC4的肿瘤特异性正常组织正常组织阳性例数阳性例数/ /总例数总例数肿瘤组织肿瘤组织阳性例数阳性例数/ /总例数总例数 胃胃1/3 胃癌胃癌2/2 肠肠2/5 结肠癌结肠癌7/7 肝肝1/1 肝癌肝癌3/3 子宫子宫3/7 子宫内膜癌子宫内膜癌3/4 大脑大脑0/1 肺癌肺癌1/2 心脏心脏0/2 食管癌食管癌1/1 脾脾2/2 卵巢癌卵巢癌4/4 胰胰0/2 乳腺癌

6、乳腺癌1/1 肾肾1/2 甲状腺甲状腺0/1 睾丸睾丸0/1 前列腺前列腺1/1 膀胱膀胱0/137.9%91.7%PBSCC43P9CC4与结肠癌组织的结合CC4对人肿瘤细胞的特异性细胞系CC4免疫反应性 膀胱癌膀胱癌 5637 膀胱癌膀胱癌 T24 绒毛膜癌绒毛膜癌 BeWo 结直肠癌结直肠癌 HT-29+ 结直肠癌结直肠癌 LS 174T+ 结直肠癌结直肠癌 SW1116+ 结直肠癌结直肠癌 SW948 十二指肠癌十二指肠癌 HuTu 80 肝细胞癌肝细胞癌 Alex 肝细胞癌肝细胞癌 HepG2+ 肺癌肺癌 A549 乳腺癌乳腺癌 MCF-7 乳腺癌乳腺癌 ZR-75-1 黑色素瘤黑色

7、素瘤 A-375 胰腺癌胰腺癌 Capan-2+ 胰腺癌胰腺癌 SW1990+一抗：一抗： CC4 二抗：二抗： FITC-amIgG FITC-amIgGHT-29SW1116CC4与人结肠癌细胞的结合Western Blot分析LS 174T细胞中的CC4抗原 消化道肿瘤特异性表达 CEA反应阳性 结肠癌组织中可溶性形式的存在 在细胞表面呈黏附分子特征性的分布 分子量130 kDCC4与几种消化道肿瘤抗原的反应性 CEA NCA Tn 酸性糖脂 神经节苷脂 + 癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen, CEA) lumenlamina正常结肠结肠癌CEA与肿瘤诊断临床

8、应用最广泛的肿瘤标志分子之一v介导肿瘤细胞间的同型黏附和异型黏附，介导肿瘤细胞间的同型黏附和异型黏附，促进迁移；促进迁移；v抑制细胞分化；抑制细胞分化；v抑制肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤细胞凋亡；v抑制抑制NK细胞的杀伤细胞的杀伤。CEA在肿瘤发生、发展和迁移中的作用51050100-505101520inhibition rate (%)antibody (g/ml) CC4 mIgGCC4抑制LS 174T细胞增殖* CC4不诱导LS 174T细胞凋亡0.96.71.28.02.010.1 CC4 mIgG non-treatedCC4破坏细胞间及细胞与基质的黏附CC4mIgGCC4抑制LS 1

9、74T细胞迁移CC4mIgG1015202530350.00.20.40.60.81.0tumor volume (cm3)days from inoculation (d) non-treated CC4CC4抑制LS 174T肿瘤生长n = 7, P 0.05scFvFabF(ab)2FvIgGRT-PCR+pCANTAB 5ESfi I/Not IPCR(Gly4Ser)3CC4 scFv的构建1 ATGAGCTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACC1 METSerTrpValLysGlnAlaProGlyLysGlyL

10、euLysTrpMETGlyTrpIleAsnThr61 TACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAA21 TyrSerGlyValProThrTyrAlaAspAspPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGlu121 ACCTCTGTCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGTCAACA41 ThrSerValSerThrAlaTyrLeuGlnIleAsnAsnLeuLysAsnGluAspThrSerThr181 TATTTCTGTGCAAGATA

11、TGCCTTCGGCTCTTGGTACTTCGATGTCAGGGGCCAAGGCACC61 TyrPheCysAlaArgTyrAlaPheGlySerTrpTyrPheAspValArgGlyGlnGlyThr241 ACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGA81 ThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly301 TCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTTCCGGGGTCCCTGCC101

12、 SerAspIleGluLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerSerGlyValProAla361 AGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCTAGGGCAGAGGGCC121 ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheSerLeuAsnIleLeuGlyGlnArgAla421 ACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATACTTATGCCGTTAGTTTTATGAACTGG141 ThrIleSerCysArgAlaSerGluSerValAspThrTyrAlaV

13、alSerPheMETAsnTrp481 TTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTGCATCCAAGCAAGGG161 PheGlnGlnLysProGlyGlnProProLysLeuLeuIleTyrThrAlaSerLysGlnGly541 CATCCTATGGAGGAGGATGATGCTGCAATGTATTTCTGTCAACAAAGTAAGGAGGTTCCG181 HisProMETGluGluAspAspAlaAlaMETTyrPheCysGlnGlnSerLysGluValPro601 TGGACGTTCGGTGGAGGGACCAA

14、GCTGGAAATAAAACGGGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTG201 TrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArgAlaAlaAlaGlyAlaProVal661 CCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG221 ProTyrProAspProLeuGluProArgAlaAla*CC4 scFv核酸及氨基酸序列MAb CC4 工作小结工作小结1.以以LS 174T活细胞活细胞为抗原免疫小鼠，构建杂交瘤，为抗原免疫小鼠，构建杂交瘤，经抗体差异筛选得到经抗体差异筛选得到MAb CC4；2.CC4具有具有肿瘤特异性，肿瘤特

15、异性，识别识别130 kD的的CEA相关蛋相关蛋白；白；3.体外实验表明体外实验表明CC4可可抑制细胞增殖、黏附和迁移抑制细胞增殖、黏附和迁移；体内实验表明体内实验表明CC4可显著可显著抑制肿瘤的生长抑制肿瘤的生长；4.克隆了单克隆抗体克隆了单克隆抗体CC4可变区的编码基因，构建可变区的编码基因，构建了了scFv。第二部分抗单克隆抗体T2-2的抗肿瘤作用正常组织正常组织 阳性例数阳性例数/ /总例数总例数 肿瘤组织肿瘤组织 阳性例数阳性例数/ /总例数总例数 肺肺 胃胃 小肠小肠 大肠大肠 结肠结肠 肝肝 胆囊胆囊 胰腺胰腺 卵巢卵巢 输卵管输卵管 子宫内膜子宫内膜 宫颈宫颈 肾肾 膀胱膀胱

16、前列腺前列腺 睾丸睾丸 脾脾 甲状腺甲状腺 肾上腺肾上腺 心脏心脏 大脑大脑 皮肤皮肤 毛囊毛囊 痣痣3/3 3/34/41/13/3 2/30/13/3 1/43/32/22/24/40/32/21/40/42/20/20/20/22/44/43/3 肺癌肺癌 食管癌食管癌 胃癌胃癌 结肠癌结肠癌 直肠癌直肠癌 肝细胞癌肝细胞癌 乳腺癌乳腺癌 卵巢癌卵巢癌 子宫内膜癌子宫内膜癌 宫颈癌宫颈癌 黑色素瘤黑色素瘤10/100/25/5 11/1114/1414/14 2/21/3 1/12/2 1/1T2-2T2-2对人体组织的特异性对人体组织的特异性甲状腺甲状腺前列腺前列腺肝肝结肠结肠子宫颈子

17、宫颈胃胃肝癌肝癌结肠癌结肠癌T2-2T2-2具有上皮细胞特异性具有上皮细胞特异性T2-2对人肿瘤细胞系的结合特异性对人肿瘤细胞系的结合特异性细胞系细胞系T2-2 免疫反应性免疫反应性 膀胱癌膀胱癌 5637 膀胱癌膀胱癌 T24 绒毛膜癌绒毛膜癌 BeWo 结直肠癌结直肠癌 HT-29 结直肠癌结直肠癌 LS 174T 结直肠癌结直肠癌 SW1116 结直肠癌结直肠癌 SW948 十二指肠癌十二指肠癌 HuTu 80 胶质细胞瘤胶质细胞瘤 BT-325 胶质细胞瘤胶质细胞瘤 U251 肝细胞癌肝细胞癌 Alex 肝细胞癌肝细胞癌 HepG2 肝细胞癌肝细胞癌 SMMC7721 肺癌肺癌 A54

18、9 乳腺癌乳腺癌 MCF-7 乳腺癌乳腺癌 ZR-75-1 黑色素瘤黑色素瘤 A-375 卵巢癌卵巢癌 SKOV-3 胰腺癌胰腺癌 Capan-2 胰腺癌胰腺癌 SW1990T2-2与与HepG2的结合依赖于固定的结合依赖于固定固固定定未未固固定定一抗：一抗： T2-2 二抗：二抗： FITC-amIgG FITC-amIgGT2-2抗原的细胞骨架状结构抗原的细胞骨架状结构细胞骨架微丝：actin中间丝微管：tubulin中间丝的分类TypeGroupLocalizationIAcidic cytokeratins: CK9-20CytoplasmIINeutral-basic cytoker

19、atins: CK1-8CytoplasmIIIDesminGlial fibrillary acidic proteinVimentinperipherinCytoplasmIVNeurofilament protein-internexinnestinCytoplasmVLaminNucleiT2-2抗原与抗原与CKs的共定位的共定位CRC HCC46 kDTissueLS 174T上清上清沉淀沉淀沉淀沉淀一抗一抗： T2-2 aCKsWestern Blot显示T2-2的单一特异性N-端C-端a-螺旋杆状区CK的结构模式LS 174T细胞中T2-2抗原的免疫沉淀 M T2-2 mIgG5

20、0 kDSDS-PAGECKs的组装过程 上皮细胞特异性表达； 位于细胞质内； 水溶液中溶解度低； 与CKs共定位； 免疫沉淀两条带。 T2-2抗原为46 kD CKCK作为肿瘤标志物的应用q血清标志物血清标志物q肿瘤来源及转移的标志肿瘤来源及转移的标志q维持细胞完整性，承受外力和渗透压，参维持细胞完整性，承受外力和渗透压，参与细胞连接；与细胞连接；q参与细胞凋亡信号传导；参与细胞凋亡信号传导；q参与肿瘤细胞的恶性转化、迁移和侵袭。参与肿瘤细胞的恶性转化、迁移和侵袭。CK的生物学功能20406080100-20-15-10-505101520inhibition rate (%)antibod

21、y (g/ml) T2-2 mIgGT2-2抑制LS 174T细胞的增殖和迁移T2-2mIgG* T2-2不诱导LS 174T细胞凋亡，不影响细胞周期0.77.71.28.047.4114.5633.5146.0715.2134.38T2-2Non-treated1015202530350.00.20.40.60.81.0tumor volume (cm3)days from inoculation (d) T2-2 non-treatedT2-2不抑制LS 174T肿瘤生长VHk kT2-2编码基因的克隆及VH/k的构建 便于检验和纯化；便于检验和纯化； 渗透性好；渗透性好； 半衰期长。半衰

22、期长。T2-2编码基因的克隆及VH/k的构建和表达Nde I/Hind IIIPCR空载体T2-2 VH/kT2-2 VH/kWBSDS-PAGE38 kD1 GAGGTGAAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTC1 E V K L Q E S G G G L V Q P G G S R K L 61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCT21 S C A A S G F T F S N F G M H W V R Q A 121 CCAGAGAA

23、GGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTGCCATTTACTAT41 P E K G L E W V A Y I S S G S S A I Y Y 181 GCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTC61 A D T V K G R F T I S R D N P K N T L F 241 CTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGTATTAC81 L Q M T S L R S E D T A M Y Y C

24、 A R Y Y 301 TACGGTAGTAGCTACGACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTC101 Y G S S Y D Y A M D Y W G Q G T T V T V 361 TCCTCAGCTAGCACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCGAGCTCGTGATGACCCAG121 S S E L V M T Q 421 ACTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGT141 T P A I L S A S P G E K V T M T

25、 C R A S 481 TCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGG161 S S V S Y M H W Y L Q K P G S S P K P W 541 ATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCT181 I Y A T S N L A S G V P A R F S G S G S 601 GGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTAC201 G T S Y

26、 S L T I S R V E A E D A A T Y Y 661 TGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA221 C Q Q W S G N P F T F G S G T K L E I K 721 CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCT241 R A D A A P T V S I F P P S S E Q L T S 781 GGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGA

27、CATCAATGTCAAG261 G G A S V V C F L N N F Y P K D I N V K 841 TGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGAC281 W K I D G S E R Q N G V L N S W T D Q D 901 AGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAA301 S K D S T Y S M S S T L T L T K D E Y E 961 CGACATAACAGCTATACCTGTGA

28、GGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAG321 R H N S Y T C E A T H K T S T S P I V K 1021 AGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAATAA341 S F N R N E C * *T2-2 VH/k的核酸序列及氨基酸序列T2-2编码基因的克隆及VH/k的构建和表达Nde I/Hind IIIPCR空载体T2-2 VH/kT2-2 VH/kWBSDS-PAGE38 kDMAb T2-2 工作小结工作小结1.以以LS 174T细胞裂解物细胞裂解物为抗原免疫小鼠，构建杂为抗原免疫小鼠，构建杂交瘤，经抗体差异筛选获

29、得交瘤，经抗体差异筛选获得MAb T2-2；2.抗原鉴定表明抗原鉴定表明T2-2识别识别46 kD细胞角蛋白细胞角蛋白；3.T2-2适用于多种免疫检测技术及多种固定剂，具适用于多种免疫检测技术及多种固定剂，具有作为细胞角蛋白有作为细胞角蛋白功能研究工具功能研究工具和肿瘤和肿瘤诊断试剂诊断试剂的利用价值；的利用价值；4.体外实验表明体外实验表明T2-2可可抑制细胞增殖和迁移抑制细胞增殖和迁移；5.克隆了克隆了T2-2抗体的编码基因，构建了新型三结构抗体的编码基因，构建了新型三结构域单链抗体域单链抗体VH/k。第三部分从人天然抗体库中筛选抗SARS-CoV抗体loxP511ITSYNVYYTKLD

30、iversity: 31011Sblattero D. & Bradbury A. Nature Biotechnology 2000,18:75-80.冠状病毒结构示意图Spike protein扫描电镜下的SARS-CoV510152025303540450.00.10.20.30.40.5OD450Clone抗SARS-CoV scFv的筛选胞周质胞周质可溶性蛋白可溶性蛋白包含体包含体抗SARS-CoV scFv基因的PCR鉴定及可溶型scFv的表达总结LS174T细胞裂解物LS174T活细胞LS174TELISA抗体差异筛选抗体差异筛选CC4T2-2 抗原为抗原为CEA相关的相关的膜蛋白膜蛋白； 抑制细胞增殖、迁移和黏附；抑制细胞增殖、迁移和黏附； 抑制肿瘤生长；抑制肿瘤生长； 构建小分子抗体构建小分子抗体scFv。 抗原为抗原为CK相关的相关的胞质胞质蛋白蛋白； 抑制细胞增