核酸分子杂交技术

1、分子生物学检测技术分子生物学检测技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术PCR技术技术 定义：定义： 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。杂交有固一液相杂交和液相杂交。 核酸分子杂R RN NA A与与R RN NA A链链之之间，间，只只要要具具有有一一定定的的互互补补碱碱基基序序列列就就可可以以在在适适当当的的条条件件下下相相互互结结合合形形成成双双链，链，用用已已知知的的D DN NA A或或R RN NA A片片断断来来检检测测未未知知的

2、的D DN NA A或或R RN NA A片片断。断。杂杂交交的的双双方方是是待待测测核核酸酸和和已已知知核核酸酸序序列，列，已已知知核核酸酸序序列列称称探探针。针。 DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子二、二、核核酸酸分分子子（一）探针的种类（一）探针的种类1、根据组成分类、根据组成分类 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针2、标记物3、标记的方式放射性同位素标记法 如32P、3H、 35S非放射性同位素标记法 如金属、半抗原、荧光素体内标记法体外标记法 化学标记法 酶促标记法DNA针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针，多为

3、某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针DNDNA探针无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记cDNry DNA）是指互补于mRNA的DNA分子。mRNA 互补DNA逆转录酶的DNA聚合酶逆转录酶的RNase HDNA聚合酶分解mRNA第二条CDNA链RN寡核苷合成制备寡核苷酸探针(如1550bp)，寡核苷酸探针的优点：短的探针比长探针杂交速度快，特异性

4、强。可以在短时间内大量制备。在合成中进行标记制成探针。可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。寡核苷酸探针可以检测小DNA片段。（二）探针的标记（二）探针的标记 1、理想标记物应具备的特性：、理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性检测方法具有高度灵敏性和高度特异性2、标记物、标记物（ 1） 理想标记物应具备的特性：理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性高度灵敏

5、性 不影响碱基配对的特异性不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性检测方法具有高度灵敏性和高度特异性（3）标记物种类标记物种类 核素标记物：核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物非核素标记物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的

6、碱性磷酸酶如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光可使发光底物发光 （3）标记方法标记方法 体内标记法：体内标记法：将核素标记的化合物作为合成将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新核素掺入到新合成的核酸分子中，如合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到胸苷可掺入到DNA中，中， 3H-尿苷可掺入到尿苷可掺入到RNA中中 体外标记法：体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基团与化学标记法：标记物分子上的活性基团与 探针分子上的某些基团反应，探针分子上的某些基团反应， 标记物直接结合到探针分子上标记物直接结合到探针分子上 酶促标记

7、法：标记物预先标记核苷酸，然酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上掺入到探针上 酶促标记法酶促标记法切口平移法（切口平移法（nick translation)利用利用DNase I在在DNA双链上造成单链切口双链上造成单链切口 利用大肠杆菌利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸外核酸外切酶活性在切口处将旧链从切酶活性在切口处将旧链从5 末端逐步切除末端逐步切除 在在DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以互补的互补的DNA单链为模板依次将单链为模板依次将dNTP连接到切连接到切口的口的3 末端末端-

8、OH上，合成新的上，合成新的DNA链，同时链，同时将标记的核苷酸掺入到新的将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中链中随机引物法随机引物法 其原理是随机引物能与各种单链其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，模板结合，作为合成新链的引物，在作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，按按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与链，其核苷酸序列与模板模板DNA完全互补。另一单链完全互补。另一单链DNA模板同样合成模板同样合成一条新的完全互补的一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的核素标记的核苷酸掺入到新合成的

9、DNA分子中分子中随机引物法所具有的优点：随机引物法所具有的优点：1、能进行双链、能进行双链DNA、单链、单链DNA或或RNA探针的标记探针的标记2、操作简单方便，避免因、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不处理浓度掌握不当所带来的一系列问题当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记PCR标记法：标记法：将标记的核苷酸作为将标记的核苷酸作为PCR反反 应的底物，以待标记的应的底物，以待标记的DNA为模板，经为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合

10、成的反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分分子中子中（三）探针的纯化（三）探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可片段，可去除去除dNTP和蛋白质和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子大分子DNA和小分子和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷、磷酸根离子及寡核苷酸（酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，

11、而此同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针法则是利用离心的方式来纯化探针 二、影响杂交的因素二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度：、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂浓度过高影响杂 交效率交效率2、温度：、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰

12、胺降低杂交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5 3、离子强度：、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4、甲酰胺：、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降

13、低杂交值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 杂交杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在液在68杂交杂交 5、核酸分子的复杂性：、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相

14、对样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于杂交率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性 6、非特异性杂交反应：、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分和高分子化合物。如鲑精子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉溶液或脱脂奶粉 三、三、 核酸分子杂交的方法核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固固-液相杂交液相杂交 膜上印

15、迹杂交膜上印迹杂交 原位杂交原位杂交 液相杂交液相杂交 RNA酶保护分析法酶保护分析法 核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法 带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳至至膜（尼龙膜或硝酸膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）纤维素滤膜）上上转膜转膜杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液转移用缓冲液转移DNADNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程（一）（一）Southern印迹杂交印迹杂交1、待测核酸样品的制备、待测核酸样品的制备 （1）裂解或破碎细胞）裂解或

16、破碎细胞 （2）抽取纯化基因组）抽取纯化基因组DNA （3）限制酶消化）限制酶消化DNA为大小不同的为大小不同的DNA片段片段2、待测、待测DNA样品的电泳分离样品的电泳分离 （1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶分离小片段用高浓度胶 （ 2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢泳动慢,小分子小分子DNA泳动快，泳动快， 大小大小 相同的分子处于同一条带相同的分子处于同一条带 （ 3）分子量标准：经）分子量标准：经Hind消化的消化的DNA，杂，杂所用分子量标准可用核素标记所用分子量标准

17、可用核素标记 3、凝胶中核酸的变性（碱变化）、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于凝胶置于NaOH溶液中使溶液中使DNA变性断裂为较短的变性断裂为较短的 单链单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 4、Southern印迹印迹 指将电泳分离的指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固片段转移到一定的固 相支持物上的过程。相支持物上的过程。（1）固相支持物的选择）固相支持物的选择理想的固相支持物应具备的特性：理想的固相支持物应具备的特性： 具有较强结合核酸分子的能力具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固与核酸分

18、子结合稳定牢固 具有良好的机械性能具有良好的机械性能 非特异吸附少非特异吸附少常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是底低。缺点是DNA分子结合不牢固分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同与膜共价结合；对不同 大小的大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低力较

19、上述两种膜低Southern印迹的常用方法印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的的DNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。 其基本原理是：其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝片段垂直向上运动，凝胶中的胶中的DNA片段

20、移出凝胶而滞留在膜上片段移出凝胶而滞留在膜上。（2）电转法）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相转移到固相支持物上。支持物上。（3）真空转移法）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。或硝酸纤

21、维素膜上。 5、Southern杂交杂交 （ 1）预杂交：封闭膜上能与）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位结合的位 预杂交液预杂交液为不含为不含DNA探针的杂交液探针的杂交液 （2）杂交：液相中的）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测探针与膜上的待测DNA双双链链DNA探针需加热变性为单链，再杂交探针需加热变性为单链，再杂交 （3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA 6、杂交结果检测、杂交结果检测 （1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 （2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针）比色或化

22、学发光检测：适于非核素标记的探针7、Southern杂交的应用杂交的应用 （1）酶切图谱分析）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量）特定基因定性和定量 （3）基因突变分析）基因突变分析 （ 4）限制性片段长度多态性的分析）限制性片段长度多态性的分析（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交 1、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同基本相同 2、鉴别、鉴别RNA 3、探针可用、探针可用DNA或或RNA片段片段 4、待测样品为总、待测样品为总RNA或或mRNANorthern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RN

23、A电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性状态，处于变性状态，DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中不变性中不变性 2、转膜：、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA（三）斑点及狭缝印迹杂交（三）斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状、狭缝印迹为线状 3、鉴别、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量、特异性不高、不能鉴别核酸分子量（四）原位杂交（四）原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交杂交 保持组织细胞的形态保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用对核酸无抽提，修饰与降解