医学微生物学病毒感染检查方法和防治原则

1、医学微生物学病毒感染检查方医学微生物学病毒感染检查方法和防治原则法和防治原则 1 1）掌握病毒的分离培养方法；）掌握病毒的分离培养方法； 2 2）熟悉标本的采集与送检原则、病毒感染的快）熟悉标本的采集与送检原则、病毒感染的快速诊断；速诊断； 3 3）了解病毒感染的免疫预防、抗病毒治疗。）了解病毒感染的免疫预防、抗病毒治疗。第一节第一节 病毒感染的检查方法病毒感染的检查方法第二节第二节 病毒感染的特异性预防病毒感染的特异性预防第三节第三节 病毒感染的治疗病毒感染的治疗第一节第一节病毒感染的检查方法病毒感染的检查方法一、标本的采集与运送一、标本的采集与运送病人急性期标本病人急性期标本标本抗生素标本

2、抗生素抑制细菌真菌繁殖抑制细菌真菌繁殖病变组织加入病变组织加入50甘油缓冲盐水低温甘油缓冲盐水低温保存，尽快送检。保存，尽快送检。70保存保存血清标本：在发病初期和发病后血清标本：在发病初期和发病后23W各取一份血清，对比双份血清抗体效价各取一份血清，对比双份血清抗体效价的动态变化。的动态变化。: 病毒的分离培养病毒的分离培养 病毒的鉴定病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定病毒数量及感染性测定二、二、病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养方法：病毒的分离培养方法： 动物接种动物接种 鸡胚培养鸡胚培养 细胞培养细胞培养: 动物接种动物接种(animal inoculation)(an

3、imal inoculation)动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等优点：结果易观察，可建立动物模型优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高、动物缺点：有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒。体内常带有潜伏病毒。 目前已很少应用。目前已很少应用。 鸡胚培养鸡胚培养(embryonated egg culture)(embryonated egg culture)受精卵受精卵孵育孵育9-149-14天天鸡胚鸡胚接种病毒接种病毒孵育孵育2-72-7天天收获相应的材料进行鉴定收获相应的材料进行鉴定尿囊腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜接种接种卵黄囊卵

4、黄囊接种接种羊膜腔羊膜腔接种接种Chick embryo inoculationChick embryo inoculationAllantoic inoculation is done mainly for production of vaccine of influenza virus. 主要用于流感病毒疫苗的生产主要用于流感病毒疫苗的生产Viral replication produces visible lesions (pocks), grey-white area in the transparent(透明的透明的) allantoic(尿囊的尿囊的) membrane. Poxv

5、irus inoculate in allantoic membrane痘病毒绒膜尿痘病毒绒膜尿囊膜接种囊膜接种优点：优点：易管理易管理 不带微生物不带微生物 成本较低成本较低缺点：缺点：操作程序复杂操作程序复杂目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒 鸡胚培养鸡胚培养(embryonated egg culture)(embryonated egg culture)根据细胞生长的方式分根据细胞生长的方式分: : 单层细胞培养（单层细胞培养（monolayer cell culturemonolayer cell culture）根据细胞来源、染色体特征及传代次数分

6、根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: : 原代培养细胞原代培养细胞 二倍体细胞株二倍体细胞株 传代细胞系或株传代细胞系或株原代培养细胞（原代培养细胞（primary cultural cells)primary cultural cells)组织组织 组织块组织块 分散的单个细胞分散的单个细胞 单层细胞单层细胞 剪碎 蛋白酶( (原代细胞原代细胞) )单层细胞单层细胞( (次代细胞次代细胞) )传代培养培养基原代培养细胞（原代培养细胞（primary cultural cells)primary cultural cells)epithelial cells特点特点: : 对多种病毒敏感对多

7、种病毒敏感 生长能力有限生长能力有限, , 获取成本高获取成本高 可携带潜伏病毒可携带潜伏病毒应用应用: : 病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定 病毒学实验研究病毒学实验研究 不能用于制备疫苗不能用于制备疫苗原代培养细胞（原代培养细胞（primary cultural cells)primary cultural cells)体外分裂体外分裂5050100100代仍保持二倍染色体数目的单型细胞代仍保持二倍染色体数目的单型细胞特点特点: : 对多种病毒敏感对多种病毒敏感 不带异种蛋白不带异种蛋白( (人源性人源性) ) 不带病毒不带病毒, ,无致瘤潜能无致瘤潜能应用应用: : 病毒分离与鉴定病毒分离与

8、鉴定 病毒学实验研究病毒学实验研究 制备疫苗制备疫苗二倍体细胞株二倍体细胞株(diploid cell strain)(diploid cell strain)fibroblastic cells传代细胞系传代细胞系(continuous cell line )(continuous cell line )特点特点: : 对多种病毒敏感性高对多种病毒敏感性高 繁殖能力强繁殖能力强, ,传代时间长传代时间长 有致癌危险有致癌危险( (来源于癌细胞或来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株突变的二倍体细胞株) )应用应用: : 病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定 病毒学实验研究病毒学实验研究 不能用于制备疫苗不

9、能用于制备疫苗能在体外无限传代的细胞系。如能在体外无限传代的细胞系。如 HeLa, Hep-2epithelioid cells: 病毒的分离培养病毒的分离培养 病毒的鉴定病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定病毒数量及感染性测定二、二、病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养与鉴定 病毒在细胞中增殖的指标病毒在细胞中增殖的指标 病毒形态学鉴定病毒形态学鉴定 病毒抗原鉴定病毒抗原鉴定 病毒病毒基因鉴定基因鉴定 病毒在敏感细胞内增殖引起特有的细胞病变。病毒在敏感细胞内增殖引起特有的细胞病变。 CPECPE：病毒感染细胞发生形态改变：病毒感染细胞发生形态改变Syncytium formation in cel

10、l culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom). CPE：病毒感染细病毒感染细 胞与邻近细胞融合胞与邻近细胞融合CPECPE：形成包涵体（：形成包涵体（inclusion bodyinclusion body）Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet. 红细胞吸附（红细胞吸附（hemadsorption, HAdhemadsorption, HAd

11、）受染细胞膜表面血凝素（受染细胞膜表面血凝素（HAHA） RBCRBC表面表面HAHA受体受体 干扰现象（干扰现象（interferenceinterference）风疹病毒人胚肾细胞风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，病毒增殖，CPECPE（）（）埃可病毒人胚肾细胞埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，病毒增殖，CPECPE（）（）人胚肾细胞人胚肾细胞风疹病毒？风疹病毒？埃可病毒埃可病毒CPE(-)CPE(-)埃可病毒埃可病毒( (+) ) 风疹病毒风疹病毒(+) (+) CPE(+)CPE(+)埃可病毒埃可病毒(+)(+) 风疹病毒风疹病毒(-)(-) 细胞代谢的改变细胞代谢的改变细胞培养瓶细胞培养瓶

12、代谢变化代谢变化-PH 病毒在细胞中增殖的指标病毒在细胞中增殖的指标 细胞病变效应细胞病变效应( cytopathic effect,CPE)红细胞吸附红细胞吸附病毒干扰作用病毒干扰作用细胞代谢的改变细胞代谢的改变 病毒在细胞中增殖的指标病毒在细胞中增殖的指标 病毒形态学鉴定病毒形态学鉴定 病毒抗原鉴定病毒抗原鉴定 病毒病毒基因鉴定基因鉴定: 病毒的分离培养病毒的分离培养 病毒的鉴定病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定病毒数量及感染性测定二、二、病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养与鉴定 病毒数量及感染性测定：病毒数量及感染性测定：50%50%组织细胞感染量组织细胞感染量蚀蚀( (空空) )斑形成试

13、验斑形成试验 病毒总量病毒总量( (活病毒活病毒+ +死病毒死病毒) )：感染性病毒量感染性病毒量: :血凝试验血凝试验概念概念: : 测定病毒感染细胞后引起测定病毒感染细胞后引起50%50%细胞病变的最小病细胞病变的最小病毒量。毒量。方法方法: :一般是将病毒悬液作一般是将病毒悬液作1010倍的系列稀释，分倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察别接种细胞，经一定时间后观察CPECPE、血细胞吸、血细胞吸附等指标，以能使附等指标，以能使50%50%细胞感染的病毒的最高稀细胞感染的病毒的最高稀释度作为终点。最后用统计方法计算出释度作为终点。最后用统计方法计算出50%50%组织组织细胞感染量

14、。细胞感染量。用途用途: : 测定感染性病毒的量和毒力测定感染性病毒的量和毒力 分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释度的HCMV感染的HEL细胞原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼脂的细胞层上产生可见和可数的局部病脂的细胞层上产生可见和可数的局部病灶称为灶称为蚀蚀斑。一个斑。一个蚀蚀斑是由一个感染性斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的，由病毒颗粒增殖而形成的，由蚀蚀斑的数目斑的数目可以计算出原始标本中感染性病毒的含可以计算出原始标本中感染性病毒的含量。量。PLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYP

15、LAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAY 分别为10-1、10-2、10-3倍稀释度的HCMV病毒液感染的HEL细胞用途：用途： 测定感染性病毒量测定感染性病毒量 单位单位: PFU (plaque forming unit)/ml: PFU (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。斑称为空斑形成单位。 分纯病毒分纯病毒 已知抗原已知抗原测抗体（诊断）测抗体（诊断） 已知抗体已知抗体测抗原（测抗原（鉴定病毒鉴定病毒属、属、种、种、 型、亚型型、亚型） 三三.

16、病毒感染的血清学诊断病毒感染的血清学诊断( (1 1) ) 中和试验中和试验(Neutralization test)(Neutralization test)(2)(2) 血凝抑制试验血凝抑制试验(H(Hemagglutinatiemagglutination ion inhibition testnhibition test) )( (3 3) ) 免疫标记法免疫标记法( (FIAFIA、EIAEIA、RIARIA) ) 蛋白印迹蛋白印迹(Western blot)(Western blot)方法：方法： 三三. 病毒感染的血清学诊断病毒感染的血清学诊断Positive immunoflu

17、orescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)HEL细胞中细胞中CMV IE1蛋白的表达蛋白的表达Enzyme immunoassay (EIA)ELISAColoured wells indicate reactivityAIDS的确诊试验的确诊试验Western blot 四四. 病毒感染的快速诊断病毒感染的快速诊断电镜和免疫电镜检查电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查普通光学显微镜检查 包涵体包涵体电子显微镜电子显微镜：可观察各种病毒的形态：可观察各种病毒的形态 但设备贵、操作复杂，但设备贵、操作复杂，应用受限应用受限光学显

18、微镜光学显微镜：可观察：可观察大病毒大病毒（痘病毒）痘病毒）和包涵体和包涵体 对一般病毒检测对一般病毒检测意义不大意义不大Inclusion bodyCytomegalic cell that contains a dense, owls eye, acidophilic intranuclear inclusion body Negry bodyp香港大学专家：患者鼻咽标本香港大学专家：患者鼻咽标本VeroVero细胞培养细胞培养CPE CPE EMEM观察：冠状病毒观察：冠状病毒p随后加拿大和美国随后加拿大和美国CDCCDC等等SARSSARS国际协作组的多个实国际协作组的多个实验室也培养

19、出了冠状病毒验室也培养出了冠状病毒p利用利用免疫荧光法免疫荧光法将分离病毒与将分离病毒与SARSSARS患者血清进患者血清进行血清学检测，反应呈阳性行血清学检测，反应呈阳性p从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用RT-RT-PCRPCR方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基因方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基因测测序序经经GenbankGenbank数据库同源性比对，发现同源性为数据库同源性比对，发现同源性为64%64%左右左右p加拿大专家完成了全基因组测序加拿大专家完成了全基因组测序发现与已知人和发现与已知人和动物的冠状病毒的同源性差异较大动物的冠状病毒的同

20、源性差异较大确定为一种新确定为一种新的冠状病毒。的冠状病毒。p荷兰的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子荷兰的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子出现出现了与了与SARSSARS病人相同的临床表现和病理特征病人相同的临床表现和病理特征再次再次从动物学实验证实引起从动物学实验证实引起SARSSARS的病原体是这种冠状的病原体是这种冠状病毒病毒pWHOWHO将其命名为将其命名为SARSSARS冠状病毒冠状病毒第二节第二节病毒感染特异性预防病毒感染特异性预防 第三节第三节病毒感染的治疗病毒感染的治疗 1 1抗病毒的化学制剂：目前抗病毒化学药物主要有核抗病毒的化学制剂：目前抗病毒化学药物主要有核苷类药物。苷类

21、药物。（1 1）核苷类药物：通过阻抑子代病毒基因的合成与表达，）核苷类药物：通过阻抑子代病毒基因的合成与表达，抑制病毒复制抑制病毒复制 . .常用药物有常用药物有: :用于用于DNADNA病毒感染病毒感染: :阿糖腺苷、碘尿苷、无环鸟苷（阿昔阿糖腺苷、碘尿苷、无环鸟苷（阿昔洛韦）、丙氧鸟苷；洛韦）、丙氧鸟苷；用于用于HIVHIV感染感染: :叠氮脱氧胸苷（叠氮脱氧胸苷（AZTAZT）广谱抗病毒广谱抗病毒:3-:3-氮唑核苷，对多种氮唑核苷，对多种RNARNA或或DNADNA病毒有抑制作病毒有抑制作用。用。 （2 2）病毒蛋白酶抑制剂：通过抑制病毒蛋）病毒蛋白酶抑制剂：通过抑制病毒蛋白酶的活性，阻止病毒的复制白酶的活性，阻止病毒的复制. . 常用药物有印地那韦、利多那韦等，对常用药物有印地那韦、利多那韦等，对HIVHIV有一定抑制作用。有一定抑制作用。 （3 3）其它抗病毒药物：金刚烷胺或甲基金）其它抗病毒药物：金刚烷胺或甲基金刚烷胺用于甲型流感的治疗，甲酸磷霉素用刚烷胺用于甲型流感的治疗，甲酸磷霉素用于疱疹病毒感染的治疗。于疱疹病毒感染的治疗。 2 2干扰素及干扰素诱生剂干扰素及干扰素诱生剂 : : 干扰素具有广谱抗病毒作用，主要用干扰素具有广谱抗病毒作用，主要用IFN-IFN-，副作用小，对某些病毒性疾病的防治有较好，副作用小，对某些病毒性疾病的防治有较好的效果的效