生物化学3动物细胞工程制药

1、第三章 动物细胞工程制药 动物细胞作为一种重要的宿主细胞，可动物细胞作为一种重要的宿主细胞，可用以下药物的生产：用以下药物的生产：v病毒病毒v疫苗疫苗v其他的各种重组蛋白其他的各种重组蛋白v单克隆抗体单克隆抗体3.1 动物细胞的形态和生理特性动物细胞的形态和生理特性3.2 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得3.3 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基3.4 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法3.5 动物细胞大规模培养的方法和操作方式动物细胞大规模培养的方法和操作方式3.6 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器3.7 动物细胞产品制造实例动物细胞产品制

2、造实例3.8 动物细胞制药的前景与展望动物细胞制药的前景与展望3.1 动物细胞的形态和生理特性动物细胞的形态和生理特性一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态 离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。 根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细胞分为胞分为贴壁依赖型贴壁依赖型和和悬浮型悬浮型两类两类。1、贴壁依赖型、贴壁依赖型 绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。和生长。 按培养细胞的贴壁的形态主要分为按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类类

3、。（1）成纤维细胞型）成纤维细胞型 形状与体内成纤维形状与体内成纤维细胞形状相似而得名，细胞形状相似而得名，细胞大致呈梭形或不细胞大致呈梭形或不规则三角形。规则三角形。（2）上皮细胞型）上皮细胞型 形状为扁平的不规形状为扁平的不规则多角型。则多角型。（3）游走细胞型）游走细胞型 在支持物上分散生在支持物上分散生长，不连接成片，呈长，不连接成片，呈活跃的游走和变形运活跃的游走和变形运动。动。（4）多形性细胞）多形性细胞 形态不规则。形态不规则。 2、悬浮型、悬浮型 少数细胞在培养时呈悬浮生长，来源于血液、淋巴少数细胞在培养时呈悬浮生长，来源于血液、淋巴组织的细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细

4、胞组织的细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞为悬浮型。为悬浮型。 形态常为球形，可悬浮培养。形态常为球形，可悬浮培养。3、兼性贴壁细胞、兼性贴壁细胞 不严格的依赖支持物不严格的依赖支持物 某些情况下可在培养基中良好悬浮生长某些情况下可在培养基中良好悬浮生长。二、动物细胞的生理特征二、动物细胞的生理特征 动物细胞培养的一些基本概念： 动物细胞体外培养可分为原代培养和传代培养（继代培养）。 原代培养是指从机体取出组织或细胞进行初次培养的过程。传代培养是指从原代培养的细胞继续转接培养。 原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。 通过选择或克隆形成法从原代培养细胞或细胞系中获得的具有特异性质或标记的细

5、胞，称为细胞株。 不能继续传代或传代次数有限的细胞系或细胞株称为有限细胞系或细胞株。 可连续传代的细胞系或细胞株称为连续细胞系或细胞株。 有限细胞系（株）可通过自发、病毒感染、癌基因转移、与其他连续细胞融合等方法转化得到连续细胞系（株）。动物细胞的生理特征动物细胞的生理特征:1. 细胞分裂周期长（细胞分裂周期长（ 1248h ） 2. 细胞生长需贴附基质，存在接触抑制细胞生长需贴附基质，存在接触抑制3. 正常二倍体细胞生长寿命有限正常二倍体细胞生长寿命有限二、动物细胞的生理特征二、动物细胞的生理特征4. 对周围环境十分敏感对周围环境十分敏感5. 对培养基要求高对培养基要求高 氨基酸、维生素、无

6、机盐、细胞生长因子、贴壁因子、氨基酸、维生素、无机盐、细胞生长因子、贴壁因子、血清等。血清等。6. 对蛋白合成途径和修饰与细菌不同（糖基化）对蛋白合成途径和修饰与细菌不同（糖基化）目前，动物细胞和细菌生产的产品，产值约各占一半。目前，动物细胞和细菌生产的产品，产值约各占一半。3.2 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要求 原代细胞原代细胞 二倍体细胞二倍体细胞连续细胞连续细胞 腺病毒疫苗和脊髓灰质炎疫苗事故（错用癌细胞）腺病毒疫苗和脊髓灰质炎疫苗事故（错用癌细胞） 皮下注射癌细胞实验皮下注射癌细胞实验 最终产品残留最终产品残留DNA

7、严格限制。严格限制。 1986年，从淋巴瘤患者分离转化细胞年，从淋巴瘤患者分离转化细胞Namalwa细胞，细胞，生生产产干扰素干扰素用于临床。用于临床。 猴肾转化细胞猴肾转化细胞Vero生产生产狂犬疫苗狂犬疫苗和和脊髓灰质炎疫苗脊髓灰质炎疫苗被批被批准大量用于人群。准大量用于人群。 1987年，杂交瘤细胞生产年，杂交瘤细胞生产OKT3单抗用于临床排异反应。单抗用于临床排异反应。 1988年后，大批异倍体传代细胞生产的重组蛋白被批准年后，大批异倍体传代细胞生产的重组蛋白被批准上市。上市。 最终产品残留最终产品残留DNA严格限制。严格限制。 二、生产用动物细胞的获得二、生产用动物细胞的获得 1 .

8、原代细胞原代细胞 直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化得到的细胞直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化得到的细胞悬液。悬液。 需要大量动物。需要大量动物。 鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴细胞。鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴细胞。 2. 二倍体细胞系二倍体细胞系 通过筛选、克隆从原代培养细胞中获得的具有某种特征的有限细胞株 有限增殖、2n、贴壁、接触抑制 MRC-5、WI-38 MRC-5： 1966年，14周正常男性胎肺组织中获得 2n=46 寿命4246代 用于人用疫苗的生产 3、转化细胞系 通过某个转化过程形成， 常由于染色体断裂成为异倍体。 自发形成，啮齿动物细胞多发； 病

9、毒感染后转化； 直接从动物肿瘤组织中建立的细胞系。 转化细胞具有无限生命力，一般倍增时间短、对培养条件和生长因子要求较低。 CHO（中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞）、COS、BHK-21、Namalwa、Vero细胞等。 COS细胞（非洲绿猴肾细胞）非洲绿猴肾细胞）： 1981年，Gluzman用复制起点缺失的SV40(猿猴空泡病毒40)转化非洲绿猴肾细胞CV-1，获得3个细胞系：COS-1、 COS-3 、 COS-7。vCOS细胞组成性表达SV40大T抗原，带有SV40 ori复制子的质粒以附加体的形式高拷贝扩增（105 拷贝）v大量扩增质粒及高表达mRNA、蛋白质，易回收和分析v易培养

10、、易转染。 CHO-K1细胞： 1957年，Puck等从中国仓鼠卵巢分离，上皮样细胞。 CHO-dhfr- 为二氢叶酸还原酶突变型(培养时需加入次黄嘌呤、胸苷)，用于工程细胞构建。 4、融合细胞系 细胞融合：两个或两个细胞合并成一个细胞的过程。 主要为杂交瘤细胞。 细胞自发融合的频率很低，需要采用人工的细胞自发融合的频率很低，需要采用人工的方式进行细胞融合，方法有方式进行细胞融合，方法有3种：种：生物方法（病生物方法（病毒）、化学方法（毒）、化学方法（PEG）、）、物理方法（电融合）物理方法（电融合） 目前，常用的为目前，常用的为PEG和和电融合电融合。（1）病毒诱导融合）病毒诱导融合 可促进

11、细胞融合的病毒有：可促进细胞融合的病毒有：疱症病毒、天花疱症病毒、天花病毒、副流感病毒、副黏液病毒病毒、副流感病毒、副黏液病毒等等。 仙台病毒仙台病毒为副黏液病毒的一种，对人危害小为副黏液病毒的一种，对人危害小而且有效，使用最广。而且有效，使用最广。 起融合作用的为病毒被膜上的起融合作用的为病毒被膜上的糖蛋白糖蛋白。 细胞融合时加入灭活的仙台病毒，两个细胞细胞融合时加入灭活的仙台病毒，两个细胞在病毒的黏结作用下靠近，通过病毒与细胞膜在病毒的黏结作用下靠近，通过病毒与细胞膜的作用使两个细胞膜相互融合。的作用使两个细胞膜相互融合。 细胞融合率较低，而且还需病毒，现已很细胞融合率较低，而且还需病毒，

12、现已很少使用。少使用。（2）PEG融合融合 诱导融合的机理还不明确。诱导融合的机理还不明确。 PEG（聚乙二醇）为乙二醇的线性多聚体，结构式为聚乙二醇）为乙二醇的线性多聚体，结构式为H(OCH2CH2)nOH ，分子量分子量1000以上为固体，以上为固体，1000以下为液以下为液体。体。 用于细胞融合的用于细胞融合的PEG分子量一般为分子量一般为10006000，浓度为，浓度为3050%。 融合效率最高可达融合效率最高可达10% 。3、电融合、电融合 细胞在强电场脉冲的作用下，细胞膜上会短暂出现小孔，细胞在强电场脉冲的作用下，细胞膜上会短暂出现小孔，如果两个细胞贴近，电脉冲时紧贴的质膜会瞬时破

13、裂而导致如果两个细胞贴近，电脉冲时紧贴的质膜会瞬时破裂而导致膜的融合，从而形成杂合细胞。膜的融合，从而形成杂合细胞。 优点：优点：融合率很高、对细胞毒性低、适合各种细胞、可融合率很高、对细胞毒性低、适合各种细胞、可用于细胞数量很少的融合过程用于细胞数量很少的融合过程。 细胞融合需要细胞融合需要经经细胞膜融合、细胞膜融合、细胞质渗透、细细胞质渗透、细胞核融合胞核融合等主要等主要步骤。步骤。 预处理预处理融合方法融合方法主要应用主要应用动物细胞动物细胞不需不需仙台病毒、仙台病毒、PEG、电电融合融合生产单克隆生产单克隆抗体抗体植物细胞植物细胞脱壁脱壁PEG、电电融合融合创造植物新创造植物新品种品种

14、微生物细胞微生物细胞 脱壁脱壁PEG高产优良新高产优良新菌种菌种 5、重组工程细胞系v构建含目的基因的真核细胞表达载体（病毒载体、质粒载体）v导入动物细胞v通过选择标记筛选工程细胞 瞬时表达 稳定表达 生产上为了获得高效稳定表达的工程细胞株。 三、细胞库的建立 除原代细胞，其他细胞系或株需要建库保存。v原始细胞库（master cell bank，MCB） 二倍体细胞：群体倍增水平尽可能低的细胞（传代次数尽可能少的细胞） 记录详细档案v工作细胞库（working cell bank，WCB） 生产用细胞库（manufacturers working cell bank，MWCB） 生产生产3.

15、3 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗、器材的清洗 新的玻璃：新的玻璃： 泡酸（泡酸（5%盐酸盐酸 12h）、刷洗、清洁液泡刷洗、清洁液泡12h（重铬酸钾重铬酸钾-硫酸洗液硫酸洗液）、）、冲洗冲洗2、水质、水质 新鲜的超纯水、双蒸水或三蒸水新鲜的超纯水、双蒸水或三蒸水 无热原无热原 3、pH值值 最适最适pH为为7.27.4，低于，低于6.8或高于或高于7.6对细胞生长不利对细胞生长不利 酚红酚红 细胞代谢产细胞代谢产乳酸乳酸 Na2HPO4/NaH2PO4 、NaHCO3/ CO2 HEPES(pKa 7.6) 10

16、50mM MOPS、DIPSO等。等。 4 4、渗透压、渗透压 理想的渗透压可保持在理想的渗透压可保持在290290300 300 mOsm(mOsm(milli - osmol )/kg)/kg，可通过增可通过增减减NaClNaCl的量调节的量调节。 1mg/ml NaCl NaCl 32 mOsm/kgmOsm/kg 1mol 1mol葡萄糖葡萄糖/kg/kg水水 冰点冰点-1.858-1.858 1000 mOsm/kgmOsm/kg 冰点冰点-0.186-0.186 100 mOsm/kgmOsm/kg 平衡盐溶液（平衡盐溶液（balanced salt solutionbalance

17、d salt solution，BSSBSS）维持渗透压、维持渗透压、pHpH 5、温度、温度 哺乳动物细胞的最佳培养温度为哺乳动物细胞的最佳培养温度为370.5，可在，可在25253535生存和生长，生存和生长， 4040以上只能存活几十分钟到几个小时。以上只能存活几十分钟到几个小时。6 6、氧气和二氧化碳、氧气和二氧化碳 二氧化碳主要调节培养基的二氧化碳主要调节培养基的pH值，二氧化碳的比例可值，二氧化碳的比例可为为35% ； 氧气影响细胞生长，溶氧过高对细胞产生毒害，过低抑氧气影响细胞生长，溶氧过高对细胞产生毒害，过低抑制细胞生长。制细胞生长。 可采用不同比例的可采用不同比例的氧气、氮气

18、、二氧化碳和空气氧气、氮气、二氧化碳和空气加以调加以调节。节。 7、抗生素、抗生素 防止微生物污染可在培养基中加入一定量的抗生素。防止微生物污染可在培养基中加入一定量的抗生素。 生产中不准使用生产中不准使用青霉素青霉素和和-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素。 8、器材的消毒灭菌、器材的消毒灭菌 物理方法：物理方法：湿热、干热、紫外线、伽马射线、过滤湿热、干热、紫外线、伽马射线、过滤。 化学方法：化学方法：化学消毒剂，化学消毒剂，主要用于空气、表面灭菌消毒、主要用于空气、表面灭菌消毒、污染物品处理污染物品处理。 二、动物细胞培养基二、动物细胞培养基 不同的动物细胞对培养基的要求差异很大，一般无规不同

19、的动物细胞对培养基的要求差异很大，一般无规律可循，常需要花费很大的时间和精力确定适合的特定律可循，常需要花费很大的时间和精力确定适合的特定细胞需要的培养基。细胞需要的培养基。 动物细胞培养基按组成大致可分为三类：动物细胞培养基按组成大致可分为三类：v天然培养基天然培养基 包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。 成分复杂、组分不稳定、来源有限。成分复杂、组分不稳定、来源有限。v补充血清的合成培养基补充血清的合成培养基 在一些在一些合成培养基合成培养基中添加中添加520%血清而成。血清而成。 最常用的血清为最常用的血清为小牛血清、胎牛血清小牛血清、胎牛血清，还有马血清等。

20、，还有马血清等。 合成培养基成分明确、组分稳定，目前商品化的有几合成培养基成分明确、组分稳定，目前商品化的有几十种（如十种（如MEM、DMEM、RPMI1640、199等），主要等），主要由成分包括：由成分包括：a.氨基酸氨基酸 必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他种类氨必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他种类氨基酸；基酸；b.维生素维生素c.能源物质（葡萄糖、谷氨酰胺）能源物质（葡萄糖、谷氨酰胺）d.无机盐无机盐e.缓冲体系缓冲体系f.其他成分其他成分 如核酸前体物质（腺苷、鸟苷等）、脂类物如核酸前体物质（腺苷、鸟苷等）、脂类物质等质等血清的作用：血清的作用：a.提供细胞生长所需的各种生长因子和

21、激素提供细胞生长所需的各种生长因子和激素b.提供细胞生长所需的贴附因子和伸展因子提供细胞生长所需的贴附因子和伸展因子c.提供可识别金属离子、激素、维生素、脂质的结合蛋白提供可识别金属离子、激素、维生素、脂质的结合蛋白d.提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。含血清培养基的缺点：含血清培养基的缺点：a.血清的来源和批次不同导致培养差异血清的来源和批次不同导致培养差异b.血清的保存期有限血清的保存期有限c.血清很容易污染杂菌血清很容易污染杂菌d.血清可能含病毒和支原体血清可能含病毒和支原体e.血清本身所含蛋白增加了产品的分离纯化难度血清本身所含蛋白增加了产品的

22、分离纯化难度f.血清供应问题血清供应问题g.成本高成本高v无血清的培养基无血清的培养基 在合成培养基中添加一些特殊成分而成：在合成培养基中添加一些特殊成分而成：a.激素和生长因子激素和生长因子 (胰岛素和表皮生长因子等胰岛素和表皮生长因子等)b.结合蛋白（铁传递蛋白、白蛋白）结合蛋白（铁传递蛋白、白蛋白）c.帖附和伸展因子（纤维结合蛋白胶原、一些多肽）帖附和伸展因子（纤维结合蛋白胶原、一些多肽）d.其他有利于细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）其他有利于细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）无血清培养基的优点：无血清培养基的优点： 提高了细胞培养的重现性、减少了血清带来的污染问提高了细胞培养

23、的重现性、减少了血清带来的污染问题、供应充足、产品易于纯化。题、供应充足、产品易于纯化。3.4 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法一、动物细胞的生长过程一、动物细胞的生长过程 大多数动物细胞为贴壁细胞，培养细胞的生长过程通常大多数动物细胞为贴壁细胞，培养细胞的生长过程通常包括包括5个个时期：时期：1、游离期、游离期 又称悬浮期，细胞接种后在培养液为悬浮状态，细胞为球又称悬浮期，细胞接种后在培养液为悬浮状态，细胞为球形。形。 10min4h。2、贴壁期贴壁期 细胞附着在固体表面，在培养开始后细胞附着在固体表面，在培养开始后10min4h 贴壁。贴壁。 细胞贴壁需要特殊的表面或其他物质，

24、如细胞贴壁需要特殊的表面或其他物质，如胶原、玻璃、胶原、玻璃、塑料塑料等。等。 血清中含有促进细胞贴壁的球蛋白、胶原、纤黏素等糖血清中含有促进细胞贴壁的球蛋白、胶原、纤黏素等糖蛋白（蛋白（促贴壁因子促贴壁因子），这些蛋白带正电荷，先吸附于固体表），这些蛋白带正电荷，先吸附于固体表面，细胞再吸附在这些促贴壁因子表面。面，细胞再吸附在这些促贴壁因子表面。 3、潜伏期、潜伏期 细胞有生长活动，但无细胞分裂。细胞有生长活动，但无细胞分裂。 6h24h。4、对数生长期对数生长期 细胞活力最高，生长速度最快。细胞活力最高，生长速度最快。5、停止期（平台期）、停止期（平台期） 固体表面长满细胞，细胞虽有活力

25、但不再分裂固体表面长满细胞，细胞虽有活力但不再分裂。二、动物细胞培养的基本方法二、动物细胞培养的基本方法 1、细胞分离、细胞分离（1）离心分离离心分离 从含有细胞体液中分离从含有细胞体液中分离 低速离心（低速离心（8001000rmp, 510min）（2）消化分离消化分离 组织块剪碎消化液消化细胞悬液洗涤组织块剪碎消化液消化细胞悬液洗涤细胞细胞 消化液：消化液： 胰蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA、胰酶胰酶-柠檬酸盐、胰酶柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶胶原酶等。等。 2、细胞计数、细胞计数（1）自动细胞计数器计数自动细胞计数器计数 无法区分死活细胞无法区分死活细胞 无法区分单个细胞和细胞团无法区

26、分单个细胞和细胞团 （2）血球计数板计数血球计数板计数 采用采用台盼蓝台盼蓝或或苯胺黑苯胺黑染色后计数可区分死活细胞。染色后计数可区分死活细胞。（3）结晶紫染色细胞核计数法结晶紫染色细胞核计数法 结晶紫染色液（结晶紫结晶紫染色液（结晶紫+ 柠檬酸柠檬酸）能使细胞分离破碎，能使细胞分离破碎，细胞核细胞核染成蓝色染成蓝色，在血球计数板计数细胞核即得细胞数。，在血球计数板计数细胞核即得细胞数。（4）MTT(四甲基偶唑盐四甲基偶唑盐)染色计数染色计数 MTT（淡黄淡黄）被活细胞）被活细胞线粒体脱氢酶线粒体脱氢酶转变为不溶的甲月替转变为不溶的甲月替（formazan，紫色紫色），溶于脱色液，比色从标准曲

27、线得细胞数。），溶于脱色液，比色从标准曲线得细胞数。 3、细胞传代、细胞传代（1）悬浮细胞悬浮细胞 稀释传代稀释传代 （2）贴壁细胞贴壁细胞 消化液（胰酶）消化倒去消化液加入消化液（胰酶）消化倒去消化液加入含血清的培养基传代含血清的培养基传代 4、细胞的冻存和复苏、细胞的冻存和复苏（1）冻存冻存 液氮（液氮（-196 ）保存）保存 冻存时细胞状态良好冻存时细胞状态良好 密度密度1 110106 6 2 10106 6 /ml 加加10%DMSO(二甲基亚砜二甲基亚砜)或甘油或甘油 降温速度降温速度 1 /min （2）复苏复苏 快融快融 从液氮罐中取出立即放入从液氮罐中取出立即放入3740 水

28、浴中。水浴中。 离心换液离心换液 或解冻后直接加培养基培养，或解冻后直接加培养基培养，46h贴壁后立即换贴壁后立即换液。液。 3.5 动物细胞大规模培养的方法和操作方式动物细胞大规模培养的方法和操作方式一、动物细胞大规模的培养方法一、动物细胞大规模的培养方法 分为分为悬浮培养、贴壁培养、假悬浮培养（微载体培养、微悬浮培养、贴壁培养、假悬浮培养（微载体培养、微囊化培养）等。囊化培养）等。 1、悬浮培养、悬浮培养 适用于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞。适用于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞。 适应于兼性贴壁细胞。适应于兼性贴壁细胞。 Wellcome公司公司 8000L搅拌罐生物反应器培养搅拌罐生物

29、反应器培养Namalwa细细胞产胞产干扰素干扰素。 Celltech公司公司2000L气升式生物反应器培养杂交瘤细胞产气升式生物反应器培养杂交瘤细胞产单抗。单抗。2、贴壁培养、贴壁培养 细胞贴附在固体表面生长以单层膜的形式生长，适用于细胞贴附在固体表面生长以单层膜的形式生长，适用于贴壁依赖性细胞与兼性贴壁细胞。贴壁依赖性细胞与兼性贴壁细胞。 动物细胞一般带负电、带动物细胞一般带负电、带正电荷的固体表面正电荷的固体表面较理想有利较理想有利于粘附细胞。于粘附细胞。 贴壁培养的材料可采用贴壁培养的材料可采用玻璃玻璃和和一次性塑料（通常为聚苯一次性塑料（通常为聚苯乙烯）乙烯）等。等。 聚苯乙烯表面疏水

30、，与细胞的相容性不好，经过聚苯乙烯表面疏水，与细胞的相容性不好，经过 射射线、化学法和放电表面改性增强其表面电荷和浸润性能，线、化学法和放电表面改性增强其表面电荷和浸润性能，成为细胞培养的理想材料。成为细胞培养的理想材料。 转瓶培养转瓶培养 15L的旋转瓶的旋转瓶 简单、比表面积小、劳动强度大。简单、比表面积小、劳动强度大。 以贴壁培养为基础，结合其他操作方式可采用采以贴壁培养为基础，结合其他操作方式可采用采用其他培养方式如用其他培养方式如微载体培养，中空纤维膜反应器微载体培养，中空纤维膜反应器培养。培养。3、微载体培养、微载体培养 微载体为直径为微载体为直径为100250um，适用于贴壁细胞

31、生长的球适用于贴壁细胞生长的球状颗粒。状颗粒。 微载体培养指将细胞贴附在微载体上进行悬浮培养。微载体培养指将细胞贴附在微载体上进行悬浮培养。 优点：优点：v培养体系的比表面积大，可随载体浓度的改变而改变，细培养体系的比表面积大，可随载体浓度的改变而改变，细胞培养密度较高胞培养密度较高v培养体系均匀，培养重复性好培养体系均匀，培养重复性好v培养基的利用率高培养基的利用率高v取样后很容易通过显微镜观察载体表面的细胞生长状况取样后很容易通过显微镜观察载体表面的细胞生长状况v收获细胞和细胞产物简单收获细胞和细胞产物简单v放大容易放大容易v对人工和空间的需求低对人工和空间的需求低 优良的微载体一般要具有

32、以下特性：优良的微载体一般要具有以下特性： v载体表面与细胞相容性良好，带较低的正电荷，适于细载体表面与细胞相容性良好，带较低的正电荷，适于细胞的附着和生长胞的附着和生长v微载体的相对密度略大于培养基，在微载体的相对密度略大于培养基，在1.031.05之间，之间，轻度搅拌就能时载体悬浮起来，停止搅拌很很快沉淀轻度搅拌就能时载体悬浮起来，停止搅拌很很快沉淀v颗粒粒度分布均匀，表面光滑利于细胞铺展颗粒粒度分布均匀，表面光滑利于细胞铺展v载体透明，容易用显微镜直接对细胞观察载体透明，容易用显微镜直接对细胞观察v材料无毒性材料无毒性v载体材料为非刚性材料，避免培养过程中相互碰撞损伤载体材料为非刚性材料

33、，避免培养过程中相互碰撞损伤细胞细胞v可以高温灭菌可以高温灭菌v惰性，不吸收或少吸收培养基组分惰性，不吸收或少吸收培养基组分v能重复使用，价廉能重复使用，价廉 微载体的材料有微载体的材料有聚苯乙烯、葡聚糖、纤维素、胶原聚苯乙烯、葡聚糖、纤维素、胶原等等。 多孔微载体多孔微载体：极大增大了比表面积：极大增大了比表面积 v加钛载体（高比重，适用于流化床反应器）加钛载体（高比重，适用于流化床反应器）v普通载体普通载体 4、微囊化培养、微囊化培养 指将动物细胞包裹在亲水的球状半透性薄膜形成的指将动物细胞包裹在亲水的球状半透性薄膜形成的微囊内。微囊内。 营养成分能透过，但细胞不能出来营养成分能透过，但细

34、胞不能出来。 适用于适用于贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞和和非贴壁依赖性细胞非贴壁依赖性细胞。 优点：优点：v减少了搅拌、通气对细胞的影响减少了搅拌、通气对细胞的影响v细胞在微小的环境中生长良好，能达到很高的细胞密度细胞在微小的环境中生长良好，能达到很高的细胞密度 制备动物细胞微囊的材料通常为制备动物细胞微囊的材料通常为海藻酸盐海藻酸盐和和多聚赖多聚赖氨酸（分子量一般在氨酸（分子量一般在40,00080,000）。 海藻酸盐是由海藻酸盐是由D-甘露糖醛酸和甘露糖醛酸和L-古罗糖古罗糖醛酸通过醛酸通过1,4糖苷键连接而成。糖苷键连接而成。 动物细胞微囊化： 海藻酸聚阴离子和聚赖氨酸聚阳离子形成聚电

35、解质的膜。 5. 包埋培养包埋培养 采用各种凝胶进行包埋后培养，主要的凝胶载采用各种凝胶进行包埋后培养，主要的凝胶载体为海藻酸凝胶、琼脂糖等。体为海藻酸凝胶、琼脂糖等。 动物细胞包埋后细胞活性不高，很少采用。动物细胞包埋后细胞活性不高，很少采用。6. 结团培养结团培养 某些结团生长的细胞某些结团生长的细胞 细胞本身作为贴附基质细胞本身作为贴附基质,可加入直径较小的颗粒可加入直径较小的颗粒（20um）促进结团促进结团 二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式 分为分为分批培养、流加培养、半连续培养、连续培养、灌流分批培养、流加培养、半连续培养、连续培养、灌流培养。培养。 1、分批培养

36、、分批培养2、流加培养、流加培养 培养过程中反应体积不断增加。培养过程中反应体积不断增加。 流加培养可以补充细胞消耗的营养物质，使细胞在较流加培养可以补充细胞消耗的营养物质，使细胞在较长时间内处于较好的环境中生长，有利于产物的形成和细胞长时间内处于较好的环境中生长，有利于产物的形成和细胞浓度提高。浓度提高。 可避免高浓度基质对细胞生长的抑制作用。可避免高浓度基质对细胞生长的抑制作用。3、半连续培养、半连续培养 培养开始时为分批培养，培养至一定程度，取出部分培养开始时为分批培养，培养至一定程度，取出部分培养液，同时反应器中补加相同的体积的培养基，再按分批培养液，同时反应器中补加相同的体积的培养基

37、，再按分批操作的方式进行培养。操作的方式进行培养。 又称为又称为反复分批培养反复分批培养或或换液培养换液培养。 优点：优点：操作简单、可反复收获产品操作简单、可反复收获产品 4、连续培养、连续培养 培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续不断培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。 细胞生长的比生长速率和稀释率相同时达到稳态，细胞细胞生长的比生长速率和稀释率相同时达到稳态，细胞浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。 优点：优点：细胞的生长环境良好稳定、可连续不断获得产细胞的

38、生长环境良好稳定、可连续不断获得产品和细胞。品和细胞。5、灌流培养、灌流培养 在细胞培养至一定程度后，将新鲜培养基不断加入反应在细胞培养至一定程度后，将新鲜培养基不断加入反应器，同时将不含细胞的培养液不断取出，细胞保留在反应器器，同时将不含细胞的培养液不断取出，细胞保留在反应器内。内。 灌注培养可保持细胞良好的培养条件，灌注培养可保持细胞良好的培养条件，不断排出有害代谢不断排出有害代谢产物产物，培养细胞能达到很高的浓度，培养细胞能达到很高的浓度，连续收获产品连续收获产品。3.6 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器 动物细胞培养规模较小，动物细胞培养规模较小，100L以上即为生产规模。以上即为

39、生产规模。1、转瓶、转瓶 仍然用于一些病毒疫苗的生产和细胞种子培养。仍然用于一些病毒疫苗的生产和细胞种子培养。2、通气搅拌式反应器、通气搅拌式反应器 动物细胞不耐剪切力，而且培养基容易产生泡沫动物细胞不耐剪切力，而且培养基容易产生泡沫。 用于动物细胞的搅拌式反应器的通气装置和搅拌桨具用于动物细胞的搅拌式反应器的通气装置和搅拌桨具有特殊的结构，可用于动物细胞培养有特殊的结构，可用于动物细胞培养。 聚丙烯中空纤维膜聚丙烯中空纤维膜 或或 薄硅胶管薄硅胶管 园底、高径比园底、高径比11.5:13、气升式反应器、气升式反应器 气体通过反应器底部的喷射管进入反应器的导流筒，气体通过反应器底部的喷射管进入

40、反应器的导流筒，使得到流筒中的液体总体密度低于外部区域，从而一直使得到流筒中的液体总体密度低于外部区域，从而一直上升，导致液体在反应器中循环。上升，导致液体在反应器中循环。 高径比大高径比大10:1。 气泡直径气泡直径12mm 空气流速空气流速0.010.06vvm 剪切力小，混合均一剪切力小，混合均一 氧和营养的传递好氧和营养的传递好 有利于设备的密封有利于设备的密封 4、中空纤维膜反应器、中空纤维膜反应器 由很多中空纤维膜（一般为超滤膜）组成的反应器。由很多中空纤维膜（一般为超滤膜）组成的反应器。 结构上分为管外空间和管内空间，细胞在管外空间生结构上分为管外空间和管内空间，细胞在管外空间生

41、长，长，贴壁细胞贴壁细胞可贴在膜外表面生长，可贴在膜外表面生长，悬浮细胞悬浮细胞可管外空间可管外空间悬浮生长，培养基从中空纤维管内通过，养分和溶氧通过悬浮生长，培养基从中空纤维管内通过，养分和溶氧通过膜的扩散到管外，代谢废物扩散至管内被带走。膜的扩散到管外，代谢废物扩散至管内被带走。 用途较广。用途较广。 细胞培养密度高细胞培养密度高 108/ml 细胞分裂停止细胞分裂停止 代谢和分化功能可代谢和分化功能可 保持数月保持数月5、平板膜反应器、平板膜反应器 悬浮细胞和贴悬浮细胞和贴壁细胞壁细胞 6、流化、流化床和固床和固定床反定床反应器应器 3.7 动物细胞产品制造实例动物细胞产品制造实例一、类

42、淋巴细胞干扰素一、类淋巴细胞干扰素(Na-IFN- ，interferon IFN) 由由Namalva细胞（淋巴瘤患者中分离获得）生产细胞（淋巴瘤患者中分离获得）生产 搅拌罐生物反应器悬浮培养（搅拌罐生物反应器悬浮培养（8000L） 80% IFN-(多种亚型多种亚型) 20% IFN-细胞逐级扩大细胞逐级扩大培养（培养（8000L）10%小牛血清小牛血清RPMI16401 110106 6 / /mlml丁酸钠或丁酸钠或IFNIFN启动启动 仙台病毒诱生仙台病毒诱生单抗或单抗或多抗亲多抗亲和层析和层析TCA沉淀沉淀超滤浓缩超滤浓缩收获离心收获离心Na-IFN-48h18hSephadex

43、G75二、组织型纤溶酶原激活剂（二、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA） 人人t-PA基因位于第基因位于第8号染色体号染色体p12q11.2区区 14个外显子和个外显子和13个内含子个内含子 全长全长36,594bp t-PA为单链为单链 527aa MW 67,00072,000 等电点等电点7.88.6, pH 5.88.0稳定稳定 17对二硫键对二硫键 三个糖基化位点三个糖基化位点 275Arg- 276Ile 能被纤溶酶、组织激肽释放酶作用裂解成双链。能被纤溶酶、组织激肽释放酶作用裂解成双链。作用机理：作用机理： 游离游离t-PA对纤溶酶原亲和力很低，不产生激活作用。对纤溶酶原亲和力很低，

44、不产生激活作用。 t-PA对血栓中纤维蛋白有很强亲和力，与纤维蛋白结对血栓中纤维蛋白有很强亲和力，与纤维蛋白结合后的合后的t-PA能够激活纤溶酶原，形成纤溶酶，纤溶酶在能够激活纤溶酶原，形成纤溶酶，纤溶酶在血栓部位水解纤维蛋白，使血栓溶解。血栓部位水解纤维蛋白，使血栓溶解。 少量进入血液的纤溶酶能可被少量进入血液的纤溶酶能可被2-抗纤溶酶抗纤溶酶作用失活。作用失活。纤维蛋白纤维蛋白t-PAt-PAt-PA纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶纤溶酶纤溶酶纤溶酶2抗纤溶酶抗纤溶酶t-PA 的生产：的生产： 采用采用CHO工程细胞株生产工程细胞株生产 微载体微载体 搅拌式灌流培养搅拌式灌流培养 、流化床灌流培养、

45、流化床灌流培养 Verax 2000(24L)流化床反应器流化床反应器 灌流灌流 330L/d，20g/d, 27d t-PA 的纯化：的纯化：螯合锌琼脂糖螯合锌琼脂糖层析层析ConA琼脂糖琼脂糖层析层析 凝胶过滤凝胶过滤Streamline SP阳离子扩张床阳离子扩张床赖氨酸赖氨酸-Sepharose 4B 赖氨酸可与赖氨酸可与t-PA 的的Kringle结构区（结构区（K2）结合结合 t-PA 用量用量 一般一般100mg（15mg/2min + 50mg/30min + 35mg/60min ） 90min内再通率内再通率 75% 颅内出血率颅内出血率 0.6%t-PA 的改造：的改造：

46、 体内半衰期很短体内半衰期很短(3.5+1.5min) Reteplase（r-PA） Tenecteplase（TNK-t-PA）(17 +7min) TNK-t-PA采用采用CHO工程细胞表达，生产工艺与工程细胞表达，生产工艺与t-PA基本基本相同，用药量由相同，用药量由100mg下降至下降至40mg。 Asn103 (Thr)Gln117 (Asn)Ala296 -Ala -Ala -Ala(Lys-His-Arg-Asp)PAI-1 纤溶纤溶酶原激活酶原激活剂抑制物剂抑制物3.8 动物细胞制药的前景与展望动物细胞制药的前景与展望一、改进表达载体一、改进表达载体 提高表达水平和产量提高表达水平和产量1、采用更强的启动子和增强子、采用更强的启动子和增强子2、利用扩增系统或寻找高表达位点、利用扩增系统或寻找高表达位点 提高基因拷贝数：提高基因拷贝数：v与筛选标记基因共扩增与筛选标记基因共扩增 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶dhfr基因，防止氨甲蝶呤基因，防止氨甲蝶呤MTX毒害毒害v自我复制型载体，以附加体形式存在自我复制型载体，以附加体形式存在 pCEP4(190) pABWN (50100) 整合到染色体整合到染色体“热点热点”: 筛选基因和报告基因两侧加入人工重组酶位点筛选基因和报告基因两侧加入人工重组酶位点 目的基因替换目的基因替换