心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化作用

1、心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化作用    【摘要】目的探讨三七总皂甙（PNS）抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化的作用及其可能的机制。方法通过反复感染柯萨奇病毒建立病毒性心肌炎慢性期小鼠模型，采用HE和VG染色观察心肌病变和纤维增生情况，采用病理检验方法对心肌胶原容积分数（CVF）和心肌血管周围胶原面积（PVCA）进行检测，并采用免疫组化法及RT?PCR法检测心肌中TGF?1蛋白及其mRNA表达水平。结果病毒性心肌炎慢性期模型组小鼠心脏出现明显心肌纤维化，与正常组比较，CVF和PVCA均显著增加（P<0.01），模型组心肌中TGF?1蛋白及其mRNA表

2、达水平均较正常组明显升高，与正常组比较，差异有显著性意义（P<0.01）；三七总皂甙治疗组可以减轻心肌病变程度，CVF和PVCA示三七总皂甙各治疗组心脏中胶原比模型组均明显减少，并且三七总皂甙治疗组心肌中TGF?1蛋白及其mRNA表达水平较模型组下降。结论三七总皂甙能下调病毒性心肌炎慢性期TGF?1的表达，抑制心肌胶原的增生，提示其抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用可能部分通过抑制PDGF?BB过度表达有关。【关键词】三七总皂甙；心肌纤维化；转化生长因子；病毒性心肌炎病毒性心肌炎（viralmyocarditis，VMC）慢性期心肌纤维化（myocardialfibrosis，MF）的

3、发病机理复杂，目前尚未发现针对性的治疗药物。现在较为肯定的具有抗心肌纤维化的药物有血管紧张素转化酶抑制剂ACEI1?2,醛固酮拮抗剂3、钙拮抗剂等4，但是由于作用单一、不良反应及价格等因素影响了临床应用。因此很多学者开始广泛研究中药对病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用，并取得了一些进展。三七总皂甙（Panaxnotoginsenosides，PNS）是五加科人参属植物三七根部提取的有效成分，现代研究发现PNS不但可以抑制组织纤维化的作用5?7，而且还具有保护心肌8、抗心率失常9及调解免疫10等作用。上述作用强烈提示PNS可能是治疗VMC慢性期心肌纤维化的理想药物，但目前还没有得到直接的实验和临

4、床支持，国内外也没有相应的文献报道。本实验将观察PNS对VMC慢性期心肌纤维化的干预作用及对TGF?1表达的影响，探讨PNS抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用及其机制。1材料和方法1.2材料(1)病毒:柯萨奇B3病毒(Nancy株，Hep?2细胞上测定TCID50=10-5)，由复旦大学医学院附属中山医院病毒性心肌炎重点实验室提供。(2)动物雄性Balb/c小鼠，56周龄，体重1618g。购自中国科学院上海实验动物中心。(3)药物与试剂PNS由云南玉溪市维和制药有限公司提供；免疫组化检测试剂盒EnVisionTMTwo?StepHistostainingReagentLot:00002568

5、101为丹麦DAKO公司的产品；TGF?1为Rabbit来源的多克隆抗体，工作浓度均为150，为武汉博士德生物公司的产品；Trizol及逆转录试剂盒：购于上海Sangon生物工程技术公司；PCR试剂盒：购于大连宝生物工程有限公司；引物：上海Sangon生物工程技术公司合成。1.2方法1.3统计学方法实验数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.5统计软件包进行统计分析处理，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较方差齐性时采用最小有意义差异法（LSD）检验，方差不齐时采用DunnettsT3检验。2结果2.1一般结果首次感染柯萨奇病毒后的小鼠第三天开始出现耸毛

6、、懒动、拱背等情况，第二次，第三次感染柯萨奇病毒后，小鼠也出现耸毛、懒动、拱背等情况，但反应较前减轻，整个造模过程小鼠共死亡20只，死亡率25%。2.2各组小鼠心肌组织病理改变情况N组小鼠心肌细胞呈短圆柱状，细胞结构清晰，胞核卵圆形，清晰可见，肌纤维排列紧密有序，心肌横纹清晰，未见肌纤维溶解、单核细胞浸润及心肌细胞坏死；心肌胶原纤维主要分布在血管周围，心肌细胞间有少量的胶原纤维；M组心肌细胞排列紊乱，胞浆较正常色淡，心肌横纹不清，炎症细胞少许可见，可见钙化灶，病变以右心室明显；而且M组除血管周围有胶原纤维外，心肌细胞间有大量纵横交错的胶原纤维，排列紊乱；各治疗组心肌细胞的病变要较模型对照组轻，

7、且胶原纤维的量也少于模型对照组，其中以T1组病变程度减轻最为明显。2.3CVF与PVCA的测定结果各组CVF与PVCA的测定结果显示，模型组心肌胶原容积分数(CVF)和心肌血管周围胶原面积(PVCA)与正常组比较均明显升高，统计学分析差异有显著性，三七总皂甙高、中剂量治疗组CVF和PVCA和模型组比较均有明显降低，统计学分析差异有显著性，三七总皂甙低剂量组CVF和PVCA和模型组比较降低，统计学分析差异无显著性（表1）。表1各组CVF和PVCA测定值的比较（略）与正常组比较,*P<0.01；与模型组比较,P<0.052.4各组小鼠心肌组织TGF?1表达的变化TGF?1在心肌细胞的胞

8、浆及间质内表达，在N组小鼠的心肌胞浆可见较少量黄色颗粒物质，TGF?1表达呈弱阳性（图1）；M组小鼠心肌细胞胞浆内布满棕黄色颗粒状物质，TGF?1呈高表达（图2），各治疗组TGF?1表达较M组表达均明显减少，统计学分析差异显著性，其半定量分析结果见表2（图3、4、5）。2.5各组小鼠心肌组织TGF?1mRNA表达的变化：N组TGF?1mRNA表达低；M组TGF?1mRNA表达较N组明显增高（P<0.01）；三七总皂甙各治疗组TGF?1mRNA表达与M组比表达降低，但统计学分析差异无显著性(见表2、图6)。表2各组小鼠心肌组织TGF?1表达的变化（略）与正常组比较,*P<0.01；与

9、模型组比较,P<0.05；与模型组比较,P>0.05图1正常组TGF?1免疫组化结果（×200）（略）图2模型组TGF?1免疫组化结果（×200）（略）图3PNS高剂量治疗组TGF?1结果（×200）（略）图4PNS中剂量治疗组TGF?1免疫组化结果（×200）（略）图5PNS低剂量治疗组TGF?1免疫组化结果（×200）（略）图6心肌组织TGF?1mRNA的表达（略）3讨论病毒性心肌炎慢性期的主要病理变化为心肌纤维化11，心肌纤维化是指心肌间质中胶原浓度显著升高或胶原容积分数(CVF)显著高于正常值。而胶原的过度沉积对心脏的功能会

10、产生一系列的影响，可引起心脏僵硬度增加，舒张功能障碍及心肌电传导异常等病理变化，是出现心力衰竭、心律失常、心脏性猝死等并发症以及由心肌炎发展到心肌病的主要原因。因此预防及控制心脏间质胶原增生是病毒性心肌炎慢性期治疗的重要环节。本研究利用反复注射CVB的方法复制病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的模型，用PNS进行治疗。发现用药45天后，模型对照组小鼠心脏组织中胶原积累明显增加，而三七总皂甙能明显减轻心脏组织中胶原的沉积，提示三七总皂甙具有抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用。心肌中胶原的过度沉积是由于胶原的生成大于降解的结果，胶原的生成和降解之间的动态平衡涉及一系列的调控因素，其中TGF?1是一种细胞

11、外间质的重要调节因子，可以促进间质胶原的合成，抑制胶原的降解。心肌中TGF?1的分泌，主要由心肌细胞和心肌成纤维细胞分泌。现代研究发现TGF?1以旁分泌/自分泌方式在心肌纤维化过程中起重要作用，其可刺激心脏成纤维细胞中、型胶原基因的表达，也可调节其胶原酶活性，减少胶原降解12。并且有研究发现病毒性心肌炎慢性期胶原的沉积增多与TGF?1的持续高表达有着密切的关系13。韩福生等也证明病毒性心肌炎慢性期TGF?1可通过上调TIMP?1mRNA的表达，使TIMPMMP比值增加，从而导致胶原在代谢中降解不足，使心肌间质胶原纤维含量增加发生过度沉积。因此可见抑制病毒性心肌炎慢性期心肌中TGF?1的持续高表达是治疗病毒性心肌炎慢性期心脏间质纤维化的重要途径之一14。此次实验结果显示，模型组TGF?1的表达水平均高于正常组，提示病毒性心肌炎慢性期心肌中T