大鼠脑液压冲击伤后细胞色素C表达的实验研究

1、大鼠脑液压冲击伤后细胞色素C表达的实验研究摘要目的为法医学上闭合性颅脑损伤的早期诊断和损伤时间推断提供依据。方法建立大鼠脑液压冲击模型。用免疫组化与图像分析技术分别检测伤后不同时间大鼠脑皮质、海马等部位细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)的表达。结果对照组大鼠脑内Cyt C有微量表达,伤后15分钟表达代写论文网开始增强,伤后3小时达高峰,1天后开始减弱,7天后基本恢复正常。结论Cyt C表达的规律性可望为闭合性颅脑损伤的早期诊断及损伤时间推断提供依据。关键词闭合性颅脑损伤;Cyt C;免疫组织化学颅脑损伤在法医病理学鉴定中十分常见。已有研究表明,脑损伤后脑血管,特别是脑内小动脉及

2、小静脉发生痉挛收缩,脑血流量减少,引起脑部缺血缺氧。细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)是呼吸链中的必要成分之一,在线粒体复合物、之间传递电子。近来有研究发现脑缺氧后神经元线粒体功能损伤并释放CytC是神经元损害的中心环节。目前关于Cyt C在闭合性颅脑损伤的诊断与损伤时间推断方面的研究报道较少。本研究对大鼠脑部进行液压冲击造成闭合性颅脑损伤,观察伤后大鼠脑内Cyt C的表达情况,以期为闭合性颅脑损伤的早期诊断及损伤时间推断提供依据。材料与方法一、实验动物分组 健康雄性Wistar大鼠50只,体重300350 g(由四川大学华西实验动物中心提供)。随机分为10组,分别对应于正常对

3、照组,手术对照组,损伤后15min、1h、3h、6h、12h、1d、4d、7d组,每组5只。二、动物模型的制备 实验动物经10%水合氯醛按0.3g/kg体重腹腔麻醉,采用张永亮改进的Dixon液压冲击装置制造损伤模型。分别于伤后15min、1h、3h、6h、12h、1d、4d、7d以4%多聚甲醛溶液进行主动脉灌注固定处死。在脑打击处尾侧3mm部位作冠状切面,常规石蜡包埋、切片。正常对照组大鼠饲养1d后直接处死,手术对照组大鼠仅行颅骨钻孔,不做液压冲击,术后2h处死。两组动物取材及组织后处理同实验组。三、主要试剂 兔抗鼠Cyt C多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。山羊抗兔SP试剂盒、DA

4、B显色剂(北京中山生物技术有限公司)。四、染色 HE染色按常规操作进行,免疫组化染色按试剂说明书进行,以PBS代替一抗作阴性对照。五、图像分析及统计学处理 在皮质及海马区随机选取5个视野,用Biomias图像分析仪测量Cyt C免疫阳性物面积及阳性细胞染色强度。测定数值用s表示,用SPSS 10.0 for Windows进行统计分析。实验结果一、HE染色观察 正常对照组和手术对照组无明显异常改变,实验见大脑皮质及蛛网膜下腔出血,脑实质小灶性出血。分神经元固缩,核小而深染,以挫伤灶周边分布居多;分神经元肿胀,弥散分布于脑实质内。伤后1h脑水明显,伤后7d损伤周边见胶质细胞增生。二、免疫组化染色

5、结果 正常对照组和手术对照组大鼠脑皮质和海马神元均有Cyt C低水平表达,光镜下,可见神经元胞浆有少许棕黄色免疫反应阳性物(见图1、2)。伤15min,大鼠脑皮质和海马神经元Cyt C表达开始增强伤后3h,大鼠脑皮质和海马神经元Cyt C表达达高峰光镜下,可见神经元胞浆内有大片棕黄色免疫反应阳物沉积(见图3、4)。免疫反应高表达持续到伤后1d,后Cyt C表达逐渐降低,伤后7d,基本恢复至对照组平。三、图像分析各组均进行了图像分析,结果见表1,2。讨论根据Ohms定律,脑血流量的调节主要依赖于灌流压和血管阻力。在血压为6.1513.85kPa范围内,脑血流量主要通过脑小动脉和微动脉血管壁平滑肌

6、收缩和舒张改变血管径而进行自动调节。于晓军等制作大鼠闭合性脑损伤模型,用扫描电镜对血管铸型进行观察,发现损伤组大鼠脑内小动脉痉挛收缩,管径明显小于正常组大鼠脑血管管径。这可能是因为机械性外力刺激脑部后,脑血管受机械性牵拉,血管平滑肌发生牵张性收缩反射的结果。脑血管痉挛收缩是外伤后脑组织缺血缺氧的主要原因。脑组织以有氧代谢为主,几乎没有无氧代谢能力,对氧的需求量高。同时,脑组织中氧和ATP的储备很少。因而对缺氧的耐受性差,是机体对缺氧最敏感的组织。缺氧后神经元线粒体ATP含量迅速下降,线粒体功能受损。线粒体功能障碍后,线粒体外膜通透性增高,Cyt C释放入细胞质,线粒体内Cyt C减少,直接使细

7、胞呼吸链电子传递中断,导致神经元坏死。释放到胞质中的Cyt C还与Apaf-1,Caspase-9一起装配组成凋亡复合体,引起神经元凋亡。坏死和凋亡正是脑损伤后神经元死亡的两种方式,只是发生的时间不同。坏死在伤后不久发生,而凋亡在伤后数小时才开始发生。Ptrick G.Sulliven等用Western Blot法研究脑损伤后神经元Cyt C的释放情况,发现伤后3h、6h、12h、24h神经元胞浆中Cyt C持续增强,72h后又有所下降,而线粒体中Cyt C的含量则随时间变化而不断下降。陈施艳等制作大鼠缺血模型,发现大鼠在常温下缺血3h后,海马CA1区神经元有大量Cyt C阳性表达,24h后表达明显减少,72h后完全消失。本研究发现在大鼠脑液压冲击伤后15min在鼠脑皮质、海马等部位C