复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

1、复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞         11-01-13 09:59:00     编辑：studa20                     作者：武重阳 孙兰军 赵英强 徐强 刘晋平【摘要】  目的 观察复方丹参滴丸

2、含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的能力。方法 采用全骨髓直接贴壁的方法分离培养大鼠MSCs，流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第四代MSCs，应用免疫细胞化学法、原位杂交组织化学法、透射电子显微镜鉴定心肌样细胞。结果 大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性，CD34、CD45、CD31阴性。经复方丹参滴丸含药血清诱导向心肌样细胞分化后，免疫细胞化学法显示辅肌动蛋白(Actinin)、结蛋白(desmin)强阳性，原位杂交组织化学法显示肌球蛋白重链(MHC)强阳性表达。结论 复方丹参滴丸含药血清能促使MSCs分化为心肌样细

3、胞，为中药干预MSCs治疗缺血性心脏病提供干细胞实验依据。 【关键词】  复方丹参滴丸;骨髓间充质干细胞;心肌样细胞;分化;活血化瘀传统观点认为心肌细胞不能再生，现在的治疗手段和措施通常不能防止左心室重构和心力衰竭的进程。目前认为干细胞可以重塑心肌细胞，有望可以替代坏死心肌组织。Tomita等1观察了自体骨髓基质细胞移植对大动物心肌再生的作用,结果提示移植细胞可形成岛样心肌细胞,促进血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收缩功能。通过骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌内移植,组织病理学和免疫组化的方法显示输入的干细胞可以分化为心肌样细胞,血管平滑肌细胞和内皮细胞2,而且能增加血管密度

4、。活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病有肯定的疗效，复方丹参滴丸具有抗心肌缺血、缺氧和扩张冠脉作用,临床主要用于治疗冠心病心绞痛。本研究旨在探讨活血化瘀中成药复方丹参滴丸能否在体外干预大鼠MSCs分化为心肌样细胞，并为诠释活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病机制提供动物实验依据。1 材料与方法1.1 试剂与器材1.1.1 试剂 DMEM低糖培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)均为Gibco公司产品，小鼠抗大鼠荧光标记抗体CD34PE(Santa Cruz)、CD106PE(Biolegend)，CD31FITC、D45FITC、CD90FITC(Serotec)，阴性对照：小鼠Ig

5、G1PE、小鼠IgG1FITC(Santa Cruz)。小鼠抗大鼠单克隆抗体sarcomeric 辅肌动蛋白(Actinin)、结蛋白(desmin)，肌球蛋白重链原位杂交试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限公司)。1.1.2 器材 CO2细胞培养箱(Thermo Forma)，H600透射电子显微镜(HITACHI)，流式细胞仪(Calibur，美国BectonDickinson公司)，6孔培养板，25 cm2、75 cm2塑料培养瓶(美国Corning公司)，倒置相差显微镜(Olympus)，Heraeus离心机(D37520，德国Osterode公司)。1.1.3 实验动物 清洁级SD大鼠，

6、雄性，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供，动物许可证号：scxk津20050001。1.2 方法1.2.1 骨髓MSCs的分离扩增 100120 g雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡510 min，无菌条件下取大鼠股骨、胫骨，去除附着于骨表面的组织，去除股骨、胫骨的骨骺，用20 ml DMEM冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，收集于离心管内，充分吹打制成细胞悬液，1 000 r/min，20离心10 min，收集细胞，用20 ml完全培养基(DMEM，20%FBS，青霉素G 100 U/ml、链霉素100 U/ml，谷氨酰胺0.2 mmol/L)重悬细胞，接种于75 cm2的塑料培养

7、瓶中，全程置于5% CO2，37，饱和湿度的孵箱中静置培养。35 d首次换液，以后每隔34 d换液洗去未贴壁细胞，原代细胞铺满整个培养瓶底面的80%90%时，用0.25%胰酶(含1%EDTA)按13进行消化传代。1.2.2 MSCs的表面抗原检测 取第四代骨髓MSCs，经0.25%胰酶(含1%EDTA)消化，PBS洗涤23次，经流式细胞仪检测细胞表面标记。1.2.3 复方丹参滴丸含药血清制备 根据成人日服药量折算成大鼠灌胃剂量，计算大鼠日灌胃剂量54.34 mg/kg。将大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每日予复方丹参滴丸含药血清灌胃，对照组予等体积蒸馏水灌胃，均连灌7 d。每日一次。最后1

8、d灌胃30 min后无菌条件下股动脉取血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，56水浴灭活30 min，过滤除菌，-20短期保存备用，制备含药血清和空白对照血清。1.2.4 复方丹参滴丸含药血清诱导MSCs 选生长状态良好的P4细胞，每孔以2×104个细胞的浓度接种于6孔培养板中，培养至细胞90%融合后分别诱导，加入含药血清，体积终浓度为20%,作用72 h后去除培养基继续培养，同时，设西药组：加入终浓度为5 mol/L的5氮胞苷,预诱导24 h后去除培养基;中西药组：加入终浓度为5 mol/L的5Aza,预诱导24 h后去除培养基，再与含药血清作用72 h去除培养基，

9、继续培养;空白组：加入空白对照血清，体积终浓度为20%，72 h后去处培养基，继续培养。倒置相差显微镜下观察721 d细胞形态变化，进行免疫组化、电镜检测。1.2.5 免疫细胞化学染色 诱导后的细胞，用4%多聚甲醛室温固定2 h，洗涤后，阻断内源性过氧化物酶，分别滴加1抗Actinin、desmin，4过夜，加生物素化兔抗小鼠IgG1第二抗体，37 45 min，PBS 液冲洗3 次，DAB 显色，自来水冲洗，苏木素复染510 min。PBS洗涤蓝化后，蒸馏水冲洗两次后，37空干后，70%甘油封片。以不加一抗作为阴性对照。1.2.6 透射电镜观察 诱导后的细胞经2.5%戊二醛固定，制成电镜标本，透射电镜下观察细胞形态结构。1.2.7 原位杂交组织化学 将诱导培养的细胞，PBS 冲洗3次，4%多