心血管蛋白芯片在急性冠脉综合征中的研究进展

1、心血管蛋白芯片在急性冠脉综合征中的研究进展         10-09-07 15:45:00     作者：谢秋平 杨金云    编辑：studa20【关键词】  心血管蛋白芯片；急性冠脉综合征；蛋白标志物急性冠脉综合征（ACS）为冠心病急症，其范围涵盖了从不稳定型心绞痛（UA）、急性非ST段抬高的心肌梗死到ST段抬高的急性心肌梗死(AMI)等一系列临床病理生理状态。其共同的病理基础是不稳定粥样斑块破裂伴随着血小板的黏附、激

2、活及聚集、血栓形成，从而导致急性、亚急性心肌缺血。研究表明炎症与免疫因素在动脉粥样硬化(AS)及其并发症中起着重要作用1。现已证实，C反应蛋白(CRP)，细胞因子如TNF、IL1、IL2、IL6、IL8等，CD40L，金属蛋白酶等参与并调节动脉粥样硬化（AS）斑块内血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等发生的炎症反应过程。而ACS病人急性心肌损伤坏死的蛋白标志物如肌钙蛋白（cTnI）、心肌型脂肪酸结合蛋白（HFABP）也证实对AMI的诊断、危险分层、预后判断有着重要的价值。早期发现这些与ACS发病机制密切相关的蛋白标志物将有助于ACS的诊断、治疗及危险分层。1  传统方

3、法研究ACS患者单蛋白标志物的现状与进展    传统的单蛋白研究方法（如酶联免疫吸附法）作为诊断和治疗的临床依据之一，可用来检测病人血清或血浆中某一种或几种蛋白标志物的含量，探讨疾病的发病机制及转归。对ACS患者循环中的炎性及炎性相关因子，心肌损伤蛋白标志物的单蛋白研究已日趋成熟。1.1  炎性蛋白标志物在ACS中的研究现状 细胞因子是由机体免疫细胞和非免疫细胞合成、分泌的，调节细胞生理功能的小分子多肽，具有高效性、多向性及内生性的特点。ACS中粥样斑块局部的炎症细胞产生和释放细胞因子，后者可激活内皮细胞、改变其天然的抗黏附和抗凝固性质。同时，

4、细胞因子能降低基质合成作用，并增加其退行性病变，有利于斑块破裂。此外，细胞因子能增加内皮细胞和巨噬细胞的合成作用，导致平滑肌细胞对局部血管收缩因子的反应性增强。参与AS炎症过程中的细胞因子主要有IL6、IL8、TNF和IL1等。TNF和IL1都能激活溶胶原酶系基质金属蛋白酶（MMPs），导致基质降解2。IL6的产生不仅与炎症反应有关，还具有促凝血功能及刺激平滑肌增殖和诱导肝细胞产生大量CRP1。Balbay等3检测了34名稳定型心绞痛(SAP)患者、15例AMI患者和20例对照组患者血清IL1水平，发现AMI和SAP组较对照组明显增高(P<0.001)。Romuk等4研究CHD患者的血浆

5、IL8水平变化，结果显示，UA患者的血IL8水平明显高于SAP患者(P0.01)和对照组(P0.02)，提示IL8在一定程度上反映冠状动脉斑块的稳定性。1.2  炎性相关的细胞因子在ACS的研究进展MMPs是一类结构中含有Zn2+和Ca2+，由巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等产生、可消化细胞外基资的重要蛋白酶类。近年来人们认为MMPs是造成冠状动脉粥样斑块不稳定的重要因素之一，可以通过消化纤维帽成分降低其强度，从而加速斑块的破裂。正常血管壁内皮细胞不能分泌MMPs，AS发生时，局部缺氧、氧化低密度脂蛋白、瘦素可诱导AS斑块内表面及斑块内新生血管壁上的内皮细胞分泌MMP1、2和9。

6、MMP1有效降解纤维胶原，MMP2和9降解基底膜，在AS斑块内皮糜烂及溃疡形成中起一定作用。Kai等应用ELISA法测定了CHD患者的血清MMP2和血浆MMP9水平，结果显示，在入院未经治疗时，UAP和AMI的MMP2水平较对照组增高2倍，MMP9水平亦分别增高3和2倍。可以认为，血MMPs水平在一定程度上反映了细胞外基质的降解，但是否能作为冠脉斑块不稳定性的参考指标仍需要进一步证实。新近Inokabo5等观察了冠脉循环中MMP9和TIMP1浓度的变化，证实了在ACS中存在活动性的斑块破裂。CD40L是一种跨膜蛋白，存在于激活的淋巴细胞和血小板以及动脉粥样斑块内的主要细胞成分(包括血管内皮细胞

7、。血管平滑肌细胞、巨噬细胞等)的表面。CD40L分为可溶性及膜结合性两型。正常动脉组织及内皮细胞没有表达。最近的研究表明，CD40与CD40L的相互作用不只局限于免疫炎症细胞的相互传递，还参与斑块内主要炎症细胞的调节，对斑块的不稳定性有着重要作用。Lutgens6等研究发现他汀类药物能使高胆固醇血症病人外周血CD40和CD40L的表达下调。国内李江等7研究通过ELISA法检测129例冠心病患者（其中AMI 46例，UA 37例，SAP 46例）及30名正常对照者血清sCD40L的浓度发现，AMI组与UA组显著高与SAP组和对照组，揭示了sCD40L与ACS发生相关。sVCAM1  黏

8、附分子是一类介导细胞以及细胞外基质黏附的糖蛋白，包括选择素家族、整合素家族、钙离子依赖黏附素家族、免疫球蛋白家族等。正常情况下，内皮细胞并不连续表达，而是通过致AS因素及其他致炎因子诱导产生。Mulvihill的研究表明，激活的内皮细胞表面表达的黏附分子释放入血，这些可溶性黏附分子的循环水平在判断AS病变活动方面具有预测性8。已有研究9证实ACS组中sVCAM1和sICAM浓度显著高于稳定性冠心病组(P0.05)及对照组(P0.01)，而ACS组中AMI与UA患者之间sVCAM1和sICAM水平无差异。这一结果与宋玮等10的报道相一致。而且动物实验已证实干预sVCAM1、sICAM、P选择素的

9、作用对心肌梗死后的组织破坏有益。应用VCAM1单克隆抗体治疗动脉损伤的动物，可部分减轻损伤，阻止血管平滑肌细胞迁移11。1.3  心肌损伤的蛋白标志物在ACS中的研究及进展心肌急性缺血损伤时常会有血清学指标的变化，如心肌肌钙蛋白（包括cTnI和cTnT），肌红蛋白（MYO）及磷酸肌酸激酶（CKMB）的改变。Tn是肌肉组织收缩的调节蛋白，主要存在于骨骼肌和心肌中，由肌钙蛋白T（cTnT），肌钙蛋白I（cTnI），肌钙蛋白C（cTnC）三个亚单位组成。骨骼肌和心肌中的Tn结构不同，所以cTn是心肌细胞特有的成分，其血清浓度的升高是心肌损伤的特异生化标志物。1987年Commins等首先报

10、道测定血清肌钙蛋白用于AMI的诊断。近年的临床研究证实，cTn作为早期心肌损伤标志物，其敏感性，特异性，以及持续时间较血清CKMB长，因此可作为ACS有价值的“金标准”。FABP是一组小分子细胞内蛋白质，平均分子量为15 kD左右，可以从心肌细胞中迅速释放入血并从尿液中排出。FABP是新近发现的一种AMI标志蛋白。目前已鉴定出了9种不同类型的FABP，其三级结构类似，均有两个螺旋和折叠结构。HFABP因其分子量小、心肌含量高，存在于胞浆中，其特点在AMI早期(通常在发病1.5 h)就有升高，510 h达到峰值，24 h回复正常，是CAD病理过程中心肌缺血的早期生化标志物。由于UAP可能是AMI

11、的前期表现，常有一过性心肌缺血或心肌微小损伤，HFABP具有早期敏感性，因此UAP患者HFABP浓度的增高更有意义，而且增高倍数与AMI组有差异12。与传统的心肌损伤标志物如MYO，CKMB等相比较，HFABP因其早期敏感性和特异性更高，在AMI的诊断、评价心脏手术时心肌损害程度及AMI溶栓效果上有许多优势。预测HFABP可能将成为判断ACS的又一新的“金标准”。1.4  NTproBNP在ACS中的研究 NTproBNP是proBNP裂解物，形成部位主要是心房和心室，是没有生物学活性的脑钠肽前体（proBNP）。以往的研究多集中于成熟BNP的生物学功能上，忽略了对没有生物

12、学活性的脑钠肽前体（proBNP）的研究。研究认为，NTproBNP在心衰患者中升高，且随着心衰的严重程度明显升高。因此NTproBNP是发现早期心功能不全敏感的标志物13。NTproBNP升高在有缺血性心脏病患者中多见，但并不和心电图及心肌缺血的生化标志物相关，也不助于诊断急性心肌缺血。所以在疑诊ACS患者，引起血浆NTproBNP升高的主要决定因素在于心功能不全而不是急性心肌缺血14。2  应用心血管蛋白芯片技术研究ACS蛋白标志物    人类基因组计划的实施、遗传学的发展和现代分子生物学技术的突飞猛进，使人们对心血管疾病有了新的认识。除了少数单基因

13、病外，心血管疾病中最多见的还是复杂性多基因疾病（如ACS、心力衰竭及高血压等）。面对庞杂的心血管疾病遗传信息，传统的单蛋白研究已不适用细胞、组织、微生物中单个蛋白的研究，而作为高通量、高灵敏度、高特异性且微型化的蛋白质芯片技术，在众多蛋白测定方法中脱颖而出。2.1  蛋白芯片技术的基本原理及特点 蛋白芯片是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后用标记了荧光、放射性核素、生物素等的蛋白质与芯片反应，经漂洗将未能与芯片上蛋白质结合的物质洗去，再利用荧光扫描仪、激光共聚焦显微镜等对信号进行检测，最后通过专门的计算机软件进行图像分析和结果解释。另外还可以利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（SELDITOFMS）或串联质谱