结直肠癌TK、PCNA表达的研究

1、    结直肠癌TK、PCNA表达的研究        摘要：目的通过对结直肠癌及腺瘤中TK和PCNA的表达，探讨其对结直肠癌的治疗、预后所起作用。方法采用免疫组织化学SABC法，检测54例结直肠癌及20例结直肠腺瘤中TK及PCNA的表达。结果本研究结果表明结直肠癌中TK及PCNA的阳性表达率均比结直肠腺瘤高(P<0.05)，结直肠癌中TK阳性表达率(64.8%)虽略比PCNA(51.9%)高，但差异无显性(P>0.05)。结论TK不仅同PCNA一样，可作细胞增殖

2、的指标，还因其参与DNA合成及细胞间“旁观者效应”等原因，从而给临床提供治疗及预后方面的有价值的参考。关键词：结直肠癌；胸腺嘧啶核苷激酶；增殖细胞核抗原；免疫组织化学中分类号：R735.3+5；R735.3+7文献标识码：A文章编号：1000-8578(2000)05-0383-02 Expression of TK and PCNA in Colorectal CarcinomaWU Jian-ping(Pathology Department of Hubei Cancer Hospital,Wuhan 430079 China)YAN Yu-hu(Pathology Department

3、 of Hubei Cancer Hospital,Wuhan 430079 China)MAO Jun,et al(Pathology Department of Hubei Cancer Hospital,Wuhan 430079 China)Abstract:Objective Expressions of TK and PCNA in Colorectal carcinoma and adenoma were studied and their relationshop with chinical therapy and prognosis of colorectal carcinom

4、a.Methods Immunohistochemistry method was used to detect the expression of TK and PCNA in 54 cases of colorectal carcinoma and 20 cases of colorectal adenoma.Results Positive expression rates of TK(64.8%) and PCNA(51.9%) in colorectal carcinoma are higher than those of colorectal adenoma(P<0.05)，

5、and the positive expression rate of TK is slightly higher than PCNA,which has no significant difference.Conclusion TK like PCNA can be used as the index of cell proliferation,and also because it takes part in the synthesize of cell DNA and its“by stander effect”,it can provide valuable reference for

6、 clinical treatment and prognosis of colorectal carcinoma.Key words:Colorectal carcinoma;Thymidine Kinase;Proliferating cellNuclear antigen;Immunohistochemistry结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一。WHO资料显示，结直肠癌在全部恶性肿瘤中，男性居第3位(15.7%)，女性居第4位(14.9%)。目前其发病率仍有逐年升高的趋势。在我国，结直肠癌亦居恶性肿瘤的46位。结直肠由于其位置关系，通过内窥镜检查，临床上常能发现很小的大肠腺瘤和大肠癌，

7、故能得到合理的治疗，如手术、放疗及化疗等。影响结直肠癌的因素很多，如病理分型、淋巴结转移情况、细胞增殖等，其中尤以细胞增殖情况为近期研究重点。PCNA是反应细胞增殖的一个常用指标，TK(Thymidine kinase,胸腺嘧啶核苷激酶)则是近年来得以应用的一个新的能反应细胞周期状况的指标。本文研究了54例结直肠癌中此2种标记物的表达情况。1材料和方法收集我院19951996年54例结直肠癌及20例结直肠腺瘤的石蜡包埋标本，所有标本经H.E染色光镜诊断。免疫组织化学方法采用SABC法，TK1抗体由Professor Qimin He(Karolinska institute,Sweden)提供

8、，PCNA抗体及SABC试剂盒购自博士德生物工程公司。免疫组化步骤大致如下：(1)切片脱蜡至水。(2)蒸馏水新鲜配置3%H2O2室温510min灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。(3)微波修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液，pH6.0，微波炉加热至96°C100°C，持续2030min，冷却后进行下一步。(4)滴加抗原修复液，室温10min。蒸馏水洗3次。(5)滴加正常血清封闭液，室温20min。去掉多余液体，不洗。(6)滴加适当稀释的一抗(TK1及PCNA)，室温120min。0.01MPBS洗2min共3次。(7)滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG,20°C

9、20min，0.01MPBS洗2min共3次。(8)滴加试剂SABC，20°C20min，0.01MPBS洗5min共4次。(9)DAB显色。(10)苏木素轻度复杂。脱水、透明、封固。显微镜观察。作TK1抗体的免疫组化时，则不再微波修复，而滴加复合消化液。结肠腺瘤分管状腺瘤、绒毛状腺瘤及混合性腺瘤，结直肠癌按WHO组织学分型：乳头状腺癌；管状腺癌：高分化、中分化、低分化；印戒细胞癌；粘液腺癌；未分化癌。2结果2.1PCNA阳性染色结果显示为细胞核着棕黄色，而TK阳性染色结果则显示为胞浆着棕黄色。具体检测结果见表1表1结直肠癌TK及PCNA检测结果TKPCNA阳性阴性阳性阴性结直肠癌3

10、5192628结肠腺瘤416515结直肠癌与结肠腺瘤之间，两种抗体表达的差异均有显著性(P<0.05)，但两种抗体表达之间则差异无显著性(P>0.05)。2.2结直肠腺瘤TK和PCNA的具体表达情况见表2。 表2结直肠腺瘤TK及PCNA检测结果TKPCNA阳性阴性阳性阴性管状腺瘤1827绒毛状腺瘤2534混合性腺瘤1313从表2看出，结直肠腺瘤的PCNA阳性表达率略比TK高，但差异并无显著性(P>0.05)。2.3结直肠癌的TK和PCNA表达情况见表3。 表3结直肠癌TK及PCNA检测结果TKPCNA阳性阴性阳性阴性管状腺癌高分化6574中分化7456低分化7254乳头状腺癌

11、8466粘液腺癌5243印戒细胞癌1102未分化癌1111从表3看出，结直肠癌的TK阳性表达率略高于PCNA，但统计学上差异无显著性(P>0.05)。 3讨论结直肠癌的预后随着诊疗手段的不断提高正逐步得到改善。传统的细胞增殖的指标如PCNA、Ki-67等虽然能反应癌细胞的总体增殖情况，但由于抗体自身的局限，给临床参考带来一定限制。有研究认为从结肠增生性息肉到结肠腺癌的过程中，PCNA呈逐渐增高的趋势1；本研究结果也支持此观点。并且在腺瘤中绒毛状腺瘤PCNA表达高，说明其增生活跃，易于癌变。对于手术患者来说，结直肠癌的手术切缘PCNA指数的评价对预测患者是否有高转移潜能和手术后易复发也有一

12、定价值，这种评价给计划合理的辅助治疗即使是早期癌也有帮助2。同时PCNA还能起到估计预后的作用，PCNA指数高的患者，其预后比PCNA指数低的患者差3。Yoshikawa等提出PCNA的免疫染色可能对筛选高危险性的结直肠癌有用4，故很多学者将PCNA用于多种肿瘤的研究，以期找到一个对肿瘤的治疗、估计预后有帮助的标记物。近来发现了一种对细胞增殖更有特异性的抗体，就是TK的抗体(TK1)，TK是一种能催化胸腺嘧啶转化为单磷酸脱氧胸腺嘧啶的酶，在DNA的合成中起着关键作用。生物化学研究表明TK1水平在G1/S期交界处开始增加，在S晚期时水平最高。TK的活性与TK1的水平有很好的相关性5。在癌细胞系及

13、人体血清中对TK1的研究比较深入，但在人体组织中的研究则不多。Thomas研究发现结肠腺瘤及有转移的结直肠癌病人中TK活性均比对照组高6。对结直肠癌的一种癌细胞系(该细胞系能稳定地表达TK基因)研究表明，当它们和TK阴性的细胞混合时，展示了一种“旁观者效应”；用Ganciclovir治疗注射有该癌细胞系的动物时，肿瘤体积显著缩小，生存期延长7。我们的研究结果表明结直肠癌的TK1阳性表达率高于结肠腺瘤，与PCNA的表达相似，均有显著差异(P<0.05)。但TK1的表达率略高于PCNA(但差异无显著性P>0.05)，与两者在细胞周期中的表达相一致。因而TK1可作为评价肿瘤细胞增殖的新指

14、标；TK1的旁观者效应还为结直肠癌的治疗提供了一个新的方向。作者单位：吴建平（430079 武汉，湖北省肿瘤医院病理科）毛军（430079 武汉，湖北省肿瘤医院病理科）阎玉虎（430079 武汉，湖北省肿瘤医院病理科）刘俐敏（430079 武汉，湖北省肿瘤医院病理科）吴传京（武汉大学测试中心）HE Qi-min（Department of Medical Radiobiology Karolinska Institute,Sweden）Sven Skon（Department of Medical Radiobiology Karolinska Institute,Sweden）WANG Na

15、i-ning（Department of Medical Radiobiology Karolinska Institute,Sweden）Bernhard Tribukait（Department of Medical Radiobiology Karolinska Institute,Sweden）参考文献：1Barletta A,Marzullo F,Pellecchia A,et al.DNA flow cytometry,P53 levels and proliferative cell nuclear antigen in human colon dysplastic,precan

16、cerous and cancerous tissuesJ.Anticancer Res,1998,18:1677-1682.2Choi HJ,Jung IK,Kim SS,et al.Proliferating cell nuclera antigen expression and its relationship to malignancy potential in invasive colorectal carcinomasJ.Dis Colon Rectum,1997,40:51-59.3Hiraga Y,Tanaka S,Haruma K,et al.Immunoreactive M

17、UCL expression at the deepest invasive portion correlates with prognosis of colorectal cancerJ.Oncology,1998,55:307-319.4Yoshikawa R,Utsunomiya J.Cell proliferation kinetics are abnormal in transitional mucosa adjacent to colorectal carcinomaJ.Br J Surg,1996,83:36-39.5Sherley,J.L.,Kelly,T.J.Regulation of human thymidine Kinase during the cell cycleJ.J Biol Chem,1988,263:8350-8358.6Thomas WM,Robertson JF,McKenna PG,et al.Se