联合显微切割及PCR方法对结外NKT细胞淋巴瘤中EB病毒的检测

1、    联合显微切割及PCR方法对结外NK/T细胞淋巴瘤中EB病毒的检测TM2O补足体积。采用Takara公司Taq酶。2琼脂糖凝胶电泳，goldview染色，凝胶成像系统上观察结果并照相。条带为181bp左右。对照设置：以已知EBV阳性的鼻咽癌组织为阳性对照，已知阴性的鼻咽部炎性组织为阴性对照，dd H2O替代模板作空白对照。 1.3统计学方法 以SPSS10.0统计软件进行四格表资料的x。检验，以P<0.05判为差异有显著意义。 2结果 2.1 PCR检测结果 56例中用PCR方法检测39例阳性(69.64)，与鼻咽部慢性炎组织(220)相比有

2、显著差异(见表1)。 2.2免疫组化检测结果 56例中用免疫组化检测EBV阳性者7例(12.5)，与鼻咽部慢性炎组织(O20)相比无显著差异(见表2)。 2.3 EBV两种检测方法比较 应用PCR方法与免疫组化方法相比较，结果有显著差异(见表3)。 3讨论 EBV检测有助于淋巴瘤增殖的不同诊断，探知治疗后疾病的残余和早期复发。PCR能利用新鲜组织，冷冻或石蜡组织，能检测已知的染色体异位，应用范围广泛。但是EBV在免疫组化中表达文献报道常不一致(经常阴性或可变的)，如VanGorp J报道结外鼻型NKT细胞淋巴瘤EBV免疫组化检测阳性率为420(20)，李百周、刘卫平以及万榕用免疫组化检测EBV

3、阳性率分别为16.7(212)、26.3(519)、50(1020)。免疫组化中表达如此不一致，给病理诊断带来了严重干扰和困惑，不利于诊断的提高。赵莎等从蛋白和DNA水平上检测了67例结外鼻型NKT细胞淋巴瘤EBV的表达情况，并观察到EBV-DNA检出率明显高于蛋白的检出率，本试验与其基本相符。表达不一致的原因，可能由于肿瘤细胞在不同分化成熟阶段EBV蛋白表达水平不同，也可能由于EBV的转录和翻译水平受其它许多因素的影响，还可能与组织经过福尔马林处理、抗原修复困难等技术原因以及所选用抗体不同有关。因为免疫组化对EBV的检出率偏低，所以对于诊断没有很大的意义。而PCR方法能有效提高EBV的检出率

4、和准确性，还可进一步进行基因分析和研究。如中国台湾地区研究22例鼻型NKT细胞淋巴瘤，发现有14例表达LMP-1，并且表现为缺失30bp的基因型，认为基因缺失型LMP-1的高表达与台湾地区EBV相关的鼻型NKT细胞淋巴瘤发病率较高有关。 我国人群中特别在南方地区EB病毒的感染率较高。目前研究认为鼻部NKT细胞淋巴瘤EBV感染率很高，高达90以上。LMP-1在离体实验中有细胞转换潜能，具有肿瘤基因产物的特征，诱导基因失调和形态学改变；诱导BCL一2基因产物的表达，阻止程序性细胞死亡，从而促进EB病毒感染细胞的永生化。研究发现LMP-1可使啮齿类动物的成纤维细胞转化并在裸鼠中成瘤，也可以引起一系列

5、的细胞粘附因子(如ICAM-1、LFAl及LFA3等)和表皮生长因子受体(EpidermalGrowth Factor Receptor，EGFR)改变，有助于细胞的生长转化与转移浸润。LMP-1还可抑制细胞凋亡，主要与NF-kB通路，MAPK通路和JAKsTAT通路等凋亡信号传导系统相关。因此，LMP-1是EB病毒致瘤的一个关键步骤。LMP-1在结外NKT淋巴瘤中的表达证明EB病毒基因组可被转录和翻译为蛋白质，说明肿瘤细胞内的EB病毒不是一个“沉默的”过路者，而是致病的重要因素，LMP-1对该淋巴瘤的形成和发展起着重要的作用。尽管目前国内外报道在淋巴瘤病变中检出EB病毒DNA，提示EB病毒可能与淋巴瘤的发生有关，但由于阳性结果仅能说明细胞中有EB病毒DNA的整合，至于EB病毒在这些病变中究竟发挥什么作用，还有待于进一步研究。EB病毒感染在鼻NKT细胞淋巴瘤发生及发展中的确切作用，是国内外同行关注的热点，已有研究发现其肿瘤组织中的EB病毒呈单克隆性，并认为EB病毒的克隆性增生发生在鼻NKT细胞淋巴瘤发病前。根据组织纯化的原理，将成分复杂的淋巴瘤在HE染色或亚甲蓝等染色下，用显微切割的方法直接分离出肿瘤细胞，再联