氟伐他汀对动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞凋亡的影响

1、氟伐他汀对动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞凋亡的影响唐丹,陈晓平*,陈国柱,刘瑞,黄明慧(四川大学华西医院,四川成都610041【摘要】目的通过研究他汀类药物稳定斑块作用中对巨噬细胞凋亡的影响以探讨在急性冠脉综合征中稳定斑块的分子机制。方法复制兔动脉粥样硬化及高脂血症模型,以氟伐他汀及安慰剂治疗,取腹主动脉,观察其斑块变化,计数斑块中巨噬细胞数量,T U N EL染色计算巨噬细胞凋亡率及SP法测巨噬细胞中Bcl-2阳性表达率。结果给药4周后,治疗组与安慰剂组比较,斑块厚度无明显变化。治疗组斑块中巨噬细胞总数低于对照组,且巨噬细胞凋亡率低于对照组。治疗组斑块中巨噬细胞Bcl-2阳性表达率,高于对照组。

2、结论氟伐他汀可以抑制兔动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的凋亡,减轻炎症反应,稳定斑块。其作用途径可能是通过了增加抗凋亡基因Bcl-2的表达。【关键词】氟伐他汀;动脉粥样硬化;巨噬细胞;凋亡【中图分类号】R543.1+2【文献标识码】A【文章编号】1672-3511(200801-0010-03Effect of Fluvastatin on apoptosis of macrophage in atherosclerotic plaqueTANG Dan,C HEN Xiao-ping,CHEN Guo-zhu,et al(Dep artment of Cardiology,H uaxi H osp

3、 ital,S ichuan Univer sity,Cheng d u610041,China【Abstract】Obj ectiveT o discuss the effect and mo lecule mechanism o f F luv ast atin on apo pto sis o f macr ophage in ather oscler otic pla que.MethodsT he athero scler otic and hyper lipemia mo dels of w hite rabbits w ere prepared by feeding hig h

4、lipid fo rag es.T w o g ro ups wer e divided at r andom:F luv astatin g r oup and co ntro l gr oup.T he r ate of apoptosis in ma cr ophag es w as det ected by T U NEL and t he r ate o f Bcl-2pro tein w as measur ed by immuno histochemical technique.ResultsT he r ate of apopto sis in macr ophages in

5、Fluvastat in g r oup w as lo wer than that in co ntro l g ro up(Pinhibits the apo pto sis o f m acr ophag es in athero scler otic plaque o f r abbits,abates inflammato ry r eactio n and stabilizes plaque.T his effect may be reached by increasing the expr ession of Bcl-2.【Key words】F luv ast atin;At

6、her osclero sis;M acr ophage;A po pt osis近年研究证实,炎症不但参与粥样斑块的形成,还影响斑块的稳定1。细胞凋亡是动脉粥样硬化(Athero scler osis,AS的重要特征2,3。尽管凋亡在AS 中的重要性不完全清楚,但现在认为凋亡性细胞死亡与斑块的不稳定、破裂和血栓形成有关4。在粥样斑块中的各型细胞,包括平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞和淋巴细胞中凋亡的强烈程度不同5。这种表现各异的凋亡强度对AS的防治有何确切作用不十分肯定。目前认为干预凋亡过程对阻止AS发展可能有重要意义。国内外他汀类的临床试验证实其可以降低血脂,降低致死及非致死性心血管病事件的

7、发生率,即稳定斑块作用;降低血中C-反应蛋白及金属蛋白酶活性,减少白细胞浸润6。虽其稳定斑块的机制尚不完全清楚,但已发现后者不能完全用他汀类的降脂作用来解通讯作者:陈晓平,T el:028-*释7。有作者发现随着血脂降低,AS斑块中巨噬细胞凋亡与增殖在发生改变6,推测该变化可能影响了斑块的稳定性。巨噬细胞作为斑块中的主要炎症细胞,其数量及增殖与凋亡的平衡在AS发展和斑块的稳定性中起重要作用,但有关他汀类对巨噬细胞凋亡的影响及相关机制的在体研究报道罕见。我们旨在通过他汀药物氟伐他汀对AS斑块中巨噬细胞凋亡的作用及相关的分子基础,以进一步探索急性冠脉综合征时稳定斑块的机制,为不稳定性斑块的治疗提出

8、新思路。1材料及方法1.1实验动物新西兰大白兔14只,雄性,体重1.5 kg左右,由四川大学动物实验中心提供。普通饲料喂养7天后以高脂喂养(1%胆固醇+10%猪油,第11周时随机抽取兔经空腹血确认高脂血症形成,处死一只确定有粥样斑块形成。停止高脂喂养,换为普通饲料,将余下13只随机分为治疗组和安慰剂组,分别以氟伐他汀及滑石粉20m g/kgd喂养共4周。4周后取空腹血,处死,取腹主动脉约6cm,肉眼观察斑块情况,以10%福尔马林固定腹主动脉。1.2血清学指标以酶法CHOD-PAP测定总胆固醇(T C,高密度脂蛋白(HDL-C,GPO-PAP法测定甘油三酯(T G。并据TC,T G,HDL-C计

9、算出低密度脂蛋白(LDL-C。试剂盒由北京柏定生物工程有限公司提供。1.3病理学指标斑块中巨噬细胞由病理科医师专人读片计数。巨噬细胞凋亡率的测定采用原位末端标记技术(TU NEL法,T UNEL试剂盒购自德国宝灵曼公司。1.4T UNEL法及免疫组化技术斑块中巨噬细胞的凋亡采用TU NEL及免疫组化法。在T UNEL技术中,凋亡的细胞核通过抗荧光抗体连接的碱性磷酸酶显色为蓝色。完整的细胞核通过核红标记并被甲基绿染成绿色。Bcl-2蛋白的检测采用标准的三步间接免疫组化法,SP法。兔多克隆抗体,即抗Bcl-2,购自博士德生物有限公司。斑块中巨噬细胞凋亡率=阳性巨噬细胞数/总巨噬细胞数×1

10、00%。斑块处巨噬细胞Bcl-2阳性表达率=Bcl-2阳性巨噬细胞数/总巨噬细胞数×100%。1.5统计学方法数据用x-±s表示,组间比较用t检验,样本率间的比较采用V2检验。以A=0.05为检验水准。2结果2.1用药前后血脂及粥样斑块的变化高脂喂养11周后兔空腹血TG、T C均升高,HDL-C降低,LDL-C 升高(t为3.2538.131,P为0.0030.000;表1。病理切片镜下见腹主动脉管腔变窄,内皮欠完整,斑块向管腔内突起,斑块中多数泡沫细胞,可见崩解破碎,有脂质沉积,中内膜处平滑肌细胞增多。从表2看,经氟伐他汀治疗4周后,仅TG无变化(t= 1.046,P=

11、0.318,其他指标两组均不同(t为3.5734.435,P 为0.0040.000。从表3看,TG、HDL-C,治疗前后均相近(t为1.010、0.042,P为0.326、0.967;而T C、LDL-C,治疗前后均不同(t为3.383、3.764,P为0.0030.001。表1高脂喂养前后血脂水平比较(x-±sTable1Serum lipid levels before and after high-cholesterin feeding高脂喂养前(n=14高脂喂养后(n=14表2用药4周后治疗组与安慰剂组血脂水平比较(x-±sTable2Serum lipid le

12、vels after4weeks of treatment with Fluvastatin or placebo(x-±s氟伐他汀组(n=6安慰剂组(n=7注:调整A=0.0127;表中数据未乘10表3氟伐他汀治疗前后血脂水平比较(x-±sTable3Serum lipid level before and after4weeks of Fluvastatin treatment(x-±s氟伐他汀治疗后(n=6氟伐他汀治疗前(n=4注:调整A=0.0127;表中数据未乘102.2氟伐他汀对斑块巨噬细胞凋亡的影响光镜下可见治疗组斑块中巨噬细胞数量较安慰剂组明显减少

13、(t=4.655,P=0.001。治疗组巨噬细胞凋亡率低于对照组(t= 4.20,P=0.002。治疗组斑块中巨噬细胞Bcl-2阳性表达率高于安慰剂组(表4。表4治疗组与安慰剂组巨噬细胞数量、凋亡率及Bcl-2阳性表达率比较(x-±sTable4The number,apoptosis rate,and positive bcl-2expression rate of macrophages in Fluvastatin and placebo groups(x-±s氟伐他汀组(n=6安慰剂组(n=7斑块中巨噬细胞数量(个23±640±73讨论3.1氟伐

14、他汀通过抑制斑块内巨噬细胞的聚集与凋亡而影响斑块稳定性。在AS中,斑块的脆弱性同两个特征相关:¹相对较大的斑块内细胞间脂质核心。º斑块中炎症细胞的浸润。斑块中巨噬细胞和T淋巴细胞的含量是斑块破裂的主要决定因素。目前认为细胞凋亡现象在AS斑块中很常见,而在正常血管壁则极为罕见。在增生活性极低的粥样斑块部位,即使仅1%的细胞凋亡率也可以显著降低斑块脂质核心的细胞构成,使之形成易于破裂的软斑块。Kockx M M等8研究认为随着血脂下降,斑块中巨噬细胞数量下降,该减少是通过细胞增殖减少实现的。同时他也发现,降脂后Wim M等9认为:与通常所说细胞凋亡时清除性的死亡通道相反,AS斑

15、块中细胞凋亡会出现大量有害影响,诱导血管壁细胞凋亡应受到限制,因为凋亡细胞释放促炎症细胞因子,吸引单核细胞和巨噬细胞局部浸润。Ko ckx M M等称AS时斑块病变中一些促凝活性的细胞因子源于正在凋亡的巨噬细胞。有研究表明,在停止高脂喂养前,斑块表现为高度细胞增殖,伴细胞凋亡发生,且主要限于巨噬细胞,而血管平滑肌细胞在TU NEL染色阳性细胞中仅占34%。此外,巨噬细胞和血管平滑肌细胞均表达Bax前凋亡蛋白,它的存在可以促进细胞凋亡。而停喂高脂后,斑块中巨噬细胞明显减少。从而有人推测:巨噬细胞介导了斑块中细胞的凋亡与增殖,影响斑块稳定性。3.2氟伐他汀对凋亡调节因子BCL-2家族作用机制探讨b

16、cl-2基因家族是细胞凋亡过程中重要的调控因子,包括BCL-2,BA X,BCL-x等。已有研究表明BAX的生物作用是拮抗BCL-2,促进细胞凋亡。BCL-2蛋白在进化过程中高度保守,其功能是通过阻断细胞凋亡而促进细胞存活,并非促细胞增生。目前认为BCL-2对细胞死亡的干扰有选择性,仅阻止细胞凋亡的最后途径10。BCL-2能抑制许多因子激发的细胞凋亡,如化疗药物、自由基、脂质过氧化、P53、钙、TNF 等。本研究发现氟伐他汀治疗后斑块中巨噬细胞凋亡减少,同时斑块巨噬细胞Bcl-2表达增加,从而支持治疗组斑块巨噬细胞凋亡减少可能与氟伐他汀抗巨噬细胞凋亡的作用有关。氟伐他汀增加巨噬细胞中Bcl-2

17、蛋白的表达,使巨噬细胞凋亡受抑,凋亡性炎性物质释放减少,进一步减少炎性细胞趋化作用及细胞损伤因子的释放,稳定斑块。但近期也有研究发现低密度脂蛋白受体缺乏的老鼠主动脉内巨噬细胞的凋亡减少会刺激AS形成11,其内部机制还应深入探讨。Blanco-Colio 等12实验中发现辛伐他汀和阿托伐他汀对体外培养的血管平滑肌细胞表现为促凋亡,并使平滑肌细胞中Bcl-2表达下调。Guijarro等13通过培养鼠的血管平滑肌细胞,分别加入不同剂量亲脂性阿托伐他汀,辛伐他汀,洛伐他汀及亲水性普伐他汀治疗,结果发现亲脂性药物以剂量依赖方式诱导V SM Cs凋亡,但等同剂量的亲水性普伐他汀则无此效应(上述研究系体外实

18、验。由此可见,斑块处巨噬细胞凋亡可能有两面性,本实验从细胞凋亡的角度研究了他汀类对AS中重要的炎症细胞巨噬细胞的作用机制,此外对AS中不同类型细胞凋亡的作用及其机制尚存在争议,以后实验中可使用T UN EL和免疫组化双染等技术,精确定位凋亡细胞组织来源。本研究发现,氟伐他汀可以抑制兔动脉AS斑块中巨噬细胞的凋亡,从而减轻炎症反应,稳定斑块。推测他汀类稳定斑块机制与抑制巨噬细胞在斑块处的聚集和凋亡有关,其作用途径可能是通过了增加抗凋亡基因Bcl-2的表达。目前对斑块中巨噬细胞凋亡的研究结果存有争议,有必要从多基因多个凋亡调控途径进一步研究。【参考文献】1Bias ucci LM,Santamar

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