阵列叉指式芯片研究细胞介电电泳富集过程

1、阵列叉指式芯片研究细胞介电电泳富集过程         11-04-23 13:21:00     编辑：studa20              作者：郝敦玲 徐溢 曾雪 曹强 温志渝 【摘要】  采用阵列叉指电极介电电泳(Dielectrophoresis，DEP)芯片，构建了集成DEP芯片分析和操控系统，应用Covento

2、rware有限元分析软件模拟分析了芯片表面的电场分布情况;以红细胞和结肠癌细胞样品为分析对象，实现了两种细胞样品在芯片上的正负介电电泳定位富集。实验发现，交流信号幅值Vpp是决定DEP富集效率的主因，交流信号频率f和缓冲溶液是改变细胞介电电泳类型的参量;在0.9% NaCl中，施加频率为10和3 MHz、电压5 V的交流频率，结肠癌细胞的正介电电泳(Positivedielectrophoresis, pDEP)和负介电电泳(Nagetivedielectrophoresis, nDEP)富集效率分别为87.2%和84.8%。 【关键词】  芯片介电电泳，细胞富集，阵列叉指电极1 引

3、 言芯片介电电泳(Microchip dielectrophoresis)是以介电电泳分离原理和微机电加工技术为基础的新型分析技术，在生化样品分析方面明显优于常规检测方法。近年来，芯片介电电泳已从最初的对中性粒子的简单富集操作，扩展到对细菌、细胞、病毒、纳米材料和金属颗粒等物质的富集、分离和操控等方面14。介电电泳(Dielectrophoresis，DEP)与流体力5、电场力6、激光镊子7等模式耦合的研究已有报道，同时将芯片介电电泳技术与其它分析方法耦合也是新的研究方向。芯片介电电泳分析系统的微电极结构是决定其分析性能的关键，因此设计出分离性能更高、结构更合理的微电极备受关注。近年来，DEP

4、芯片电极构型已由传统的平面式电极发展为三维式电极，出现了夹板式电极、笼式电极和绝缘柱式电极等多种结构8，9。本研究以阵列叉指电极式DEP芯片为核心单元构建DEP芯片分析系统，在对叉指电极表面的电场分布情况和介电电泳力作用范围进行计算模拟的基础上，以红细胞和结肠癌细胞为研究对象，应用构建的DEP芯片分析系统对细胞样品的介电电泳富集过程进行系统研究，以期为快速高效检测复杂体系中细胞样品奠定理论和技术基础。2 实验部分2.1 仪器与试剂Agilent 33220A型任意函数信号发生器(安捷仑公司); IX71奥林巴斯荧光倒置显微镜(日本Olympus公司); Alpha Innotech型微泵(美国

5、Alpha公司); Qcapture pro.图像采集处理软件， Camtasia Studio屏幕录制软件。Sylgard184有机硅弹性体即聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS;美国道康宁公司)，用于浇注PDMS盖片。缓冲液配制： 分别精确称取4.000 g NaCl， 0.100 g KCl， 1.744 g Na2HPO4·12H2O和0.100 g KH2PO4， 溶解并定容至500 mL容量瓶中，配制成磷酸盐缓冲液(PBS)。抗凝剂配制：称取EDTA2Na 4.0 g溶解定容于100 mL容量瓶中。0.9%NaCl医用生理盐。以上试剂均用0

6、.22 m高温灭菌后的微孔滤膜过滤后备用。样品：红细胞(red blood cell, RBC)形状呈双面凹陷的圆盘状，直径约7.5 m;116型结肠癌细胞(colon cancer cell)呈圆球形，直径约15 m。所有细胞样品均由重庆第三军医大西南医院临床检验科提供。2.2 实验步骤2.2.1 阵列叉指电极DEP芯片制作及分析系统搭建 DEP芯片的底片为键合有Au电极的玻璃片，阵列叉指电极宽度和间距均为30 m，玻璃底片尺寸为25 mm×17 mm×2 mm，由中国科学院大连化学物理研究所外协制作。采用PDMS制作DEP芯片的盖片。将PDMS预聚体和固化剂按质量比10

7、:1混合均匀，浇注于硅烷化处理后的SU8管道阳膜上，脱气后于60 恒温干燥箱中固化4 h，室温冷却后小心剥离PDMS盖片，用孔径为3 mm的打孔器在PDMS盖片上打孔备用，形成的微管道宽150 m，深30 m，长10 mm。将带有微管道的PDMS盖片依次用乙醇、二次蒸馏水、乙醇清洗后风干备用。键合Au电极的玻璃底片用丙酮轻轻擦洗并风干，备用。最后将玻璃底片与PDMS盖片密合，抽负压吹干，即完成阵列叉指电极式DEP复合式结构芯片的制作，芯片实物和电极构型如图1所示，芯片分析系统构建如图2所示。a. 进样口(Inlet); b. 废液池(Outlet); c. 注射微泵(Injection mic

8、ropump); d. 注射器(Injection syring); e. 信号发生器(Signal generator); f. 示波器(Digital oscilloscope); g. 电源控制器(Power controller). 分 析 化 学第37卷第9期郝敦玲等：阵列叉指式芯片研究细胞介电电泳富集过程 2.2.2 影响细胞DEP富集的因素 (1)缓冲介质固定交流信号幅值Vpp为5 V，在不同频率f下，考察红细胞在PBS和0.9%NaCl两种缓冲溶液中的介电电泳富集过程; (2)交流信号幅值Vpp 选择0.9%NaCl医用生理盐水为缓冲溶液，固定交流信号频率为10 MHz，考察V

9、pp在110 V范围逐步变化时，红细胞和结肠癌细胞的富集过程; (3)频率f 选择0.9%NaCl医用生理盐水为缓冲溶液，固定交流信号幅值Vpp为5 V，考察f在120 MHz范围逐步变化时，红细胞和结肠癌细胞的富集过程。2.2.3 结肠癌细胞介电电泳富集 以116型结肠癌细胞作为分析对象，缓冲溶液选用0.9% NaCl，细胞浓度为103104 cell/mL，Vpp=5 V，分别在10 MHz和3 MHz条件下，对结肠癌细胞进行DEP富集实验。3 结果与讨论3.1 阵列叉指电极式DEP芯片上电场分布模拟依据芯片介电电泳原理，通过有限元方法数字化程序，在建立合适的二维模型基础之上，模拟不同的几

10、何结构电极的电场分布，在给定的边界条件和参数下，预测电场梯度的变化。这不仅有利于确定最优的电极结构，还能确定介电电泳的有效作用区域10。本实验采用Coventorware有限元分析软件对DEP芯片管道内的电场分布进行了模拟。在2 V 1 MHz的交流信号下，电极宽度和间距与芯片实际尺寸相同均为30 m，阵列叉指电极表面不同高度处的E分布情况如图3所示。当叉指电极宽度和间距为30 m时，电极表面电场梯度分布差异明显，电场梯度最大的位置出现在叉指电极的边缘，为细胞受正介电电泳(Positivedielectrophoresis, pDEP)时的富集位置;电场梯度最小的位置出现在两电极之间，为细胞受

11、负介电电泳(Nagetivedielectrophoresis, nDEP)时的富集位置，故而在此芯片上可以实现细胞样品在不同位置的DEP富集。从图3还可以看到，随着距电极表面距离的增加，E显著降低，DEP作用力明显下降。当距离达到30 m时，E接近于零，介电作用力几乎消失。因此，可确认30 m是DEP力的有效作用范围，将其作为DEP芯片管道高度可实现对样品对象的有效DEP操控。3.2 影响细胞介电电泳富集的因素根据介电电泳原理，细胞所受的介电电泳力F=20mr3RefCM|Erms|2, 其中0和m分别为真空介电常数和介质介电常数，|Erms|2为电场强度绝对值的拉普拉斯算符， RefCM为

12、ClausiusMossotti因数，其中fCM=*p-*m*p+2*m, *p和*m分别代表细胞和缓冲液的综合介电常数，*=-i/，其中是介电常数，i代表-1，是电导率，为外加电场的角频率。因此，在实验中可以通过改变缓冲介质配比、外加电场电压和频率等参数来实现粒子的定向操控和分离分析等目的。3.2.1 交流信号幅值Vpp对细胞DEP富集的影响 细胞所受介电电泳力除与电场强度E2成正比外，还与细胞半径r3成正比。因此，当Vpp相同时，结肠癌细胞的富集速度要明显快于红细胞的富集速度。实验选择0.9% NaCl医用生理盐水为缓冲溶液，固定交流信号输出频率为10 MHz，实验考察了不同Vpp时两种细胞富集的情况。 图4 红细胞和结肠癌细胞在不同电压下的富集时间1. 红细胞(Red blood cell, RBC ); 2. 结肠癌细胞(Colon cancer cell)。首先界定从开始施加交流信号到细胞DEP富集过程完成细胞不再运动为止的时间为细胞的富集时间t，实验测得细胞富集时间t随Vpp的增加而减小，且同一电压下结肠癌细胞的富集时间明显小于红细胞(如图4)。当Vpp<3 V时，D