PCR技术原理及实验操作

1、PCR技术原理及实验操作一、PCR的基本原理和步骤基本原理DNA复制 碱基互补配对原则A=T，G=C一级结构的文字式缩写基因基因TGCAGGTTAAAGG它的互补链它的互补链:ACGTCCAATTTCC(误误)CCTTTAACCTGCA(正正)3-ACGTCCAATTTCC-5(正正)ATGCAAA-TA-TATCGCGGCGCATTTATGCCGA-TA-TATCGGCGCA -TATGCTACGTAA-TA-TATCGGCG-C二、PCR的成分 模板模板 （Template DNA） 引物引物 （Primer） Taq DNA聚合酶聚合酶 dNTP Taq聚合酶缓冲液聚合酶缓冲液 （Taq

2、 Buffer） 所有成分在同一离心管中所有成分在同一离心管中模板是一段单链或者双链DNA，提供用于进行PCR扩增的原始信息对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等模板浓度过高会导致非特异性扩增增加模板DNA应该尽量保持低温保存引物一段短的单链DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链引物浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降 ；浓度过低产物量少Taq DNA聚合酶 以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具

3、备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于20，内含甘油保存最适反应温度72 ，即延伸温度在配制PCR体系的最后加 入 酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量dNTP脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dUTP等在内的统称，即合成新的DNA链的材料4种dNTP 的浓度相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量Buffer 维持Taq酶扩增的最适条件和稳定性Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活剂过高: 非特异扩增增加 过低 : 使Taq酶活性丧失，反应产物减少 注意事项所有的PCR体系都应该在-20 保存除了d

4、dH2O之外，完全融化之后再加入，以免影响浓度配制反应体系应在冰上操作或快速进行，以减少非特异性扩增体系配制完成之后应马上进行PCR反应分装处理，专人专用，防止交互污染三、PCR的步骤三个步骤变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension)-Taq酶作用下，不断向引物3端添加DNTP，DNA链不断延伸反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：变性变性94度，退火度，退火58度，延伸度，延伸72度。度。123452255729

5、4时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95变变 性性第一轮扩增第一轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点58引物1引物2DNA引物退退 火火PCR的基本原理PCR反应条件PCR

6、过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶延延 伸伸PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50TaqTaqTaqTaq72PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的特点PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RF

7、U 细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速 一次性加好反应液，24 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低1.血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的反应体系标准的PCR反应体系 10X 扩增缓冲液： 5l 模板DNA: 0.12g 引物： 各0.21mol/L 4种dNTP: 各200mol/L Mg2+ Taq DNAUddH2O 补齐 总体积： 50lu可以按照比例放大或者缩小体系，不同的可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化反应需要优化u按照实验方案进行即可按照实验方案进行即可PCR实验的设计除实验样品外，每个PCR反应都必须

8、有阳性和阴性对照-针对模板阳性：验证PCR反应体系和条件的正确性阴性：验证PCR反应有无污染PCR循环参数 94 ，3min；94 ，45s；58 ，1min； 循环30次72 ，1min；72 ，10min；16 保温（热力学参数）（热力学参数）1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 94 ，3min；94 ，45s；58 ，1min； 循环30次72 ，1min；72 ，10min；16 保温 94 预变性，3min使DNA双链

9、完全打开退火： 58，1min 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。变性： 94 变性，45s 使双链DNA解链为单链延伸：72 ，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 时间由扩增片段的长度决定 1min扩增1KB 循环次数： 主要取决于模板DNA的浓度 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加第二节 凝胶电泳(gel electrophoresis)电泳概念基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度 电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳() 聚丙烯酰胺凝胶电

10、泳 琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理 操作要点 应用范围（一）分离核酸原理 电荷效应 分子筛效应 分子构象1. 电荷效应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷8.3 , 负电荷，向正极移动在电泳缓冲液中，DNA带负电荷，在电场作用下向正极移动电泳不能使用蒸馏水，必须使用电泳缓冲液 小分子移动快 ，大分子移动慢3. 分子构象闭环超螺旋线状DNA开环DNA +-（二）操作要点支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色1. 支持物-琼脂糖琼脂糖是由1，3连接的B-D-半乳呋喃糖和1，4连接的

11、3，6脱水-L-半乳呋喃糖相间联结而成。琼脂中除琼脂糖外，尚含有琼脂糖果胶(Agaropectin)和丙酮酸等带电荷基团分子，在琼脂糖制备过程中尽可能地去除掉这些带电荷分子去除掉这些带电荷分子，以便获得品质优良的电荷中性产品中性产品。商品化的琼脂糖西班牙琼脂糖琼脂糖agrose与与 细菌培养用琼脂琼脂agar的区别2. 凝胶浓度的选择凝胶的制备注意：使用电泳缓冲液进行配制；加热过程中要不时摇动，使附着于壁上的琼脂糖颗粒进入溶液溶解。3. DNA marker 上样3l，750bp条带为50ng，其它25ng上样3l，500bp条带为50ng，其它25ngDNA 长度标准曲线4. 电泳缓冲液 T

12、ris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(凝胶制备时一定要使用电泳缓冲液 5. 样品制备 DNA 样品每条带100ng上样缓冲液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青作用：上色；沉降 点 样恒压电泳 低压: 12V/cm 中压: 810V/cm 高压：几十V/cm温度：1525 溴化乙锭(ethidium bromide, EB)荧光基团，在紫外光下显色紫外灯下显色Pipetman移液器（枪）的使用法国Gilson 德国Eppendorf芬兰 Dragon工欲善其事必先利其器工欲善其事必先利其器根据实验需要选择合适量程的移液器在该过程中，

13、千万不要将按钮旋出量程，否则会卡内部机械装置而损坏了在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡内部机械装置而损坏了移液枪。移液枪。卡紧的标志是略为超过卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈用大拇指将按钮按下至第一档，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按用大拇指将按钮按下至第一档，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一档排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二档吹出残余的液体。最后至第一档排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二档吹出残余的液体。最后先将移液器从液体中取出，后松开按钮。先将移液器从液体中取出，后松开按钮。注意按至吸液档时不要插入液面之下，否则会产生气泡。注意按至吸液档时不要插入液面之下，否则会产生气泡。吸液档（第一档）和放液档（第二档）吸液档（第一档）和放液档（第二档）移液器的正确放置使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液器使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。弹簧。用大量程的移液器移取小体积的液体用大量程的移液器移取小体积的液体移液