高级生物化学2

1、等电聚胶电泳(IFE)：利用一种特殊的缓冲液(两性电解质)，在聚丙烯酰氨凝胶制造一个pH梯度，电泳时，每种蛋白质迁移到它的等电点(pI)处，即梯度的某一pH时，就不再带有净的正负电荷了。蛋白质一级结构: 蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键位置测定蛋白质一级结构的一般步骤: 测定蛋白质分子中的多肽链数目-拆分蛋白质分子的多肽链-测定多肽链的氨基酸组成-测定多肽链的C端和N端残基-断裂多肽链内的二硫键-用两种以上的方法将多肽链断裂为数个肽段-测定个肽段的氨基酸顺序-用拼版法确定多肽链的氨基酸排列顺序-确定肽链间的二硫键测序步骤：(1)纯化蛋白质 (2)拆分多肽链、断开二硫键 还原法：-巯

2、基乙醇、碘乙酸；氧化法：过甲酸；变性剂：高浓度尿素溶液 (3) 测定多肽链的氨基酸组成 (4) N末端和C末端的氨基酸测定 N端：Sanger法，DNFB+氨基酸DNP(黄色)+HF；DNS(丹磺酰氯)法，产生强烈荧光；Edman法，PITC+氨基酸PTH-AA(能溶于有机溶剂)；氨肽酶法，就是用这类肽链外切酶从多肽链的N端逐个的向里切。C端：肼解法、还原法和羧肽酶法 (5)两种以上方法专一性的裂解成两套以上肽段 酶解法：胰蛋白酶(水解Arg、Lys)、胰凝乳蛋白酶(水解Phe、Tyr、Trp)；化学法：溴化氢专一性的水解Met、羟胺法 (6) 分别将肽段纯化，测出其氨基酸顺序 Edman降解

3、法、DNS- Edman降解法、蛋白质测序仪等 (7) 片段重叠法拼凑出整条多肽链氨基酸顺序 (8) 确定多肽链中SS交联桥的位置蛋白质的二级结构: 在规则氢键指导下，局部主肽链在空间的排列种类 1.螺旋（helix）表示为“nsR或L”其中n表示上升一圈的氨基酸残基数，s表示氢键形成的环中所含的原子数，R或L表示螺旋的旋转方向2 b折叠片 3.回折4.发夹5.无规则卷曲6.三股螺旋7.b突起蛋白质的超二级结构：是指相邻二级结构单元按一定规律组合，形成空间上可以区别的结构单位类型：1.卷曲的卷曲螺旋2.X单元3.迂回4.回型拓扑结构5.折迭桶6.螺旋回折螺旋结构域（doman）是指蛋白质一条多

4、肽链上出现的紧密的、相对独立的区域。类型：（1）螺旋结构域（2）折叠结构域（3）+结构域这种结构域中两种二级结构单元都存在，并且二者是随机出现的（4）/结构域这种结构域中两种二级结构单元都存在，但是这两种二级结构单元是有规律的交替出现（5）无规则卷曲结构域（6）回折结构域结构域间的结构关系：从空间结构看结构域之间有的只是通过一条柔软的肽链连接，而有的接触面比较大。从一级结构上看，每个结构域在一级结构上都是连续的，即结构域之间只是通过一条肽链连接的。蛋白质三级结构（tertiary structure）是指蛋白质分子中全部原子的空间排列。特点：首先，球状蛋白往往利用各种结构单元折叠成紧密的球状结

5、构其次球状蛋白质分子的疏水基团主要趋向于内部，而亲水基团主要分布于表面其次球状蛋白质分子的疏水基团主要趋向于内部，而亲水基团主要分布于表面第三、蛋白质表面的下陷区往往是蛋白质执行功能的部位，第四，同类球状蛋白，具有基本相同的三级结构，不同的球状蛋白，其三级结构是不同的。球状蛋白的分类：1.全-结构蛋白质2. ， -结构蛋白质3.全-结构蛋白质4.富含金属或二硫键（小的不规则）蛋白质蛋白质的四级结构（quaternary structure）就是亚基在空间的排列方式四级结构的优越性：减少遗传错误，其次可以扩大功能，节省模板，形成一定的几何构型，从而形成特殊结构的蛋白质。蛋白质的结构原则：1手性原

6、则（handed principle）：蛋白质从低级结构形成高级结构时要遵从右手原则2、疏水表面积最小原则。蛋白质形成三级结构时，要使其疏水的表面积尽量达到最小，这样有利于蛋白质学细胞中的稳定。3、自我装配原则。新合成的肽链只是线性结构，从这样的结构形成特定的空间结构，要经过精细的装配过程。血红蛋白的变构效应血红蛋白从脱氧状态（脱氧血红蛋白）转变为氧结合状态（氧合血红蛋白）过程中其空间结构要发生变化波尔（Bohr）效应H+、CO2对血红蛋白结合氧的影响相对离心力(relative centrifugal foceRCF) RCF = 1.11910-5（r/min)2rg图表法根据旋转半径（r

7、）、RCF、r/min 的列线计算图进行换算离心机 (centrifuge)1. 制备离心机 根据其最大转速可以分为以下几种： 普通离心机：最大转速 6 000r/min， 最大相对离心力6 000g用途：固液沉淀分离 高速离心机：最大转速 25 000r/min， 最大相对离心力90 000g用途：菌体、细胞碎片、细胞器等的分离超速离心机 (ultracentrifuge)：最大转速 80 000r/min， 最大相对离心力500 000g用途：细胞器分级分离、病毒、DNA、RNA、蛋白质分离提纯等 2. 分析离心机 常用离心技术1. 沉淀离心 选定一定的时间、速度进行离心，使样品液中的大的

8、固型物与液体分离，从而获得沉淀或上清夜。又称为固液分离法。使用普通离心机2. 差速离心（差级离心、差分离心） 在均匀介质中，利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。3. 密度梯度分离：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。用途：是制备高纯度物质的常用方法聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶性质：（1）机械强度高、有弹性、透明（2）性质稳定 常用pH、温度、缓冲液不受影响（3）有分子筛效应，抗对流（4）亲水且为中性（5）不溶性、不污染样品，可微量操作（6）通过控制凝胶浓度，孔径大小可以控制分离原理（1）浓缩

9、效应 胶层不连续 离子成分不连续 电位梯度不连续 pH不连续（2）分子筛效应凝胶孔径与蛋白质分子大小在一个数量级，各种蛋白质都可通过，但是阻力不同，小分子可很容易地通过，大分子需要从凝胶孔中挤过去。（3） 电荷效应等电聚焦凝胶电泳（isoelectric focusing , IEF）等电点相差0.010.02则可分开SDS凝胶电泳 SDS（十二烷基磺酸钠，样品蛋白中加入SDS、巯基乙醇巯基乙醇作用：打开二硫键SDS作用：作用于亚基 不同蛋白质的区别只有分子量，因此电泳后可按分子量大小不同而分离。但是测出的只是亚基的分子量。 为了得到蛋白质分子量，电泳时必须加标准蛋白（marker）一起电泳分

10、子量（MW）与迁移率（Rf）的关系：Lg MW =bRf + k双向凝胶电泳 1. 第一向 IEF 利用圆盘电泳仪进行等电聚焦凝胶电泳，得到圆柱型胶。2. 第二向 SDS凝胶电泳层 析（chromatography）凝胶层析、G-10 G表示凝胶，数字为得水值，即 吸水量/克干胶100。得水值越大，凝胶的孔径越大。蛋白质在凝胶中的速度决定于内水、外水的分配系数（Kd）Kd=Ve-VoVi 大分子：不进入颗粒，Ve=Vo，Kd=0，速度最快 小分子：完全进入颗粒，Ve=Vo+Vi，Kd=1，速度最慢中等大小分子：Vo+ViVe Vo，即1Kd 0操作 溶胀装柱 层析再生. 用途 脱盐：通常使用的

11、是G10G50，因为它们的孔径小，蛋白质不能进入凝胶内，只有盐离子可以进入。所以可以将蛋白质与盐分开。 分离提纯蛋白质 浓缩：小网孔的干凝胶可以吸水，使用它会使高分子溶液得到浓缩。 测定分子量：蛋白质分子量的对数（lg MW）与Ve/Vo呈线性关系，可以利用标准蛋白划出标准曲线。由曲线则可得到未知蛋白的分子量。离子交换层析、不同蛋白所带电荷不同，与交换剂的结合力也不同，通过改变洗脱液离子强度或pH，可将蛋白质根据其结合力从弱到强依次分离。亲和层析、将在不溶性的载体上结合一种特定物质（配基）作为亲和吸附剂然后装柱进行层析。分配层析、吸附层析。复制（replication）：以亲代DNA分子为模板

12、指导合成相同的子代DNA分子的过程。复制方式为即全保留、半保留和分散式。原点（origin）局部双链解开，形成复制眼只形成一个复制叉（replication fork）冈崎片段：冈崎（Okazaki）用3H-T标记噬菌体感染的E.coli，然后短时间内分离DNA，则得到1000个碱基左右的片段，真核生物则为100-200个核苷酸片段，称为冈崎片段。真核生物DNA比E.coli的DNA大的多复制叉移动速度慢10倍（复制叉速度：E.coli5000/min，真核10003000/min）真核细胞DNA有多个原点。整个分子分为多个复制子，每个长度100 200bp ，且都为双向复制。1. 大肠杆菌D

13、NA聚合酶DNA聚合酶I、II、III、共五，DNA聚合酶、是修复酶，存在与SOS修复系统DNA聚合酶II手掌域的功能A.两个催化位点，一个掺入正确的dNTP,另一个去除错误的dNTPB.聚合部位功能：含两个金属离子，促进催化反应；通过与新和成的DNA的双螺旋小沟形成多个氢键，检查新掺入的核苷酸碱基配对的正确性C.外切核酸酶活性和校对功能位点手指域功能A.引入dNTP，并将正确的dNTP送到催化部位。B.弯曲模板，以利于模板的碱基与结合的核苷酸形成氢键。C.稳定焦磷酸拇指域功能与合成的DNA相互作用，以维持引物和活性部位的正确位置，维持聚合酶与其底物的强有力作用。夹子的作用：包围结合新合成的双

14、链DNA以及结合有引物-模板的聚合酶保证聚合酶极快地重新结合于引物-模板结合部位增加聚合酶聚合反应的持续性(5000nt) DNADNA连接酶（ligase）单链结合蛋白（single strand binding protein SSB）功能：防止单链再次形成双链，防止核酸酶水解多核苷酸链，保护DNA。DNA聚合酶 包括引发酶、DNA连接酶、DNA解螺旋酶、单链结合蛋白、DNA拓扑异构酶（topoisomerase）拓扑异构酶的功能：双链DNA超螺旋与松弛态的相互转换、单链结状DNA和环状无结状DNA的相互转换、单链互补环状DNA正、负链形成环状DNA、双链环状DNA环连或解环连。起始子（r

15、eplicator）和起始因子（initiator）终止区终止Ter：终止区多拷贝序列，每个20bp。是一个复制叉的终止区。两个区是交叉的，只有通过另一个终止区，才能到达自己的终止区。Tus蛋白：识别、结合Ter区，形成Ter-Tus复合体。Tus可阻止一个方向复制叉的解链，但为另一个方向的复制叉让路。真核生物DNA聚合酶共有五种，为DNA聚合酶、延长与原核生物机理基本一致，酶与蛋白差异不同DNA 的复制方式凯恩斯模型（型）（Cairns model ）双链环状DNA的复制方式滚环模型（rolling circle model）双链环状DNA复制方式、单链环状DNA复制方式、线粒体DNADNA

16、复制方式、D环复制模型反转录过程：正链 RNA-引物 tRNA结合于 RNA近5端-开始合成负链 ，DNA到-RNA5端停止，合成了带强终止子的负链片段-RNA5R端区降解 -负链 DNA片段跳到RNA3端，以其区与 RNA3端R区互补R合成负链 DNA-移去 tRNA 引物-RNA 降解，留下部分片 段作为 DNA 合成引物合成带强终止子正链 DNA-正链 DNA 跳到负链 DNA 3端互补结合 -完成负链 DNA 合成-完成正链 DNA 合成。反转录的特点1. 三种反应 (RNA DNA RNA 降解， DNA DNA) 由一个酶催化 RNADNA，2. 负链 DNA 合成的天然引物是 t

17、RNA ，是引物 18bp RNA 互补结合。正链合成的 天然引物是分解后的 RNA 片段 tRNA。3 实现了两次飞跃 4.cDNA 的两条链是分步合成的聚合酶链式反应（PCR） 系统：模板（DNA片段）、酶、引物、底物（4种dNTP）DNA的损伤与修复1.DNA复制中的损伤:（1）碱基错配（2）核苷酸插入或删除（3）校对的“疏忽”2 损伤种类:碱基聚合,碱基错配,脱氨基,碱基丢失.DNA损伤的修复1、错配修复2、切除修复（1）碱基切除修复（2）核苷酸切除修复1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸3）DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链4）DNA连

18、接酶将切口补平. （3）偶联转录切除修复: 机理 RNARNA聚合酶识别DNADNA损伤部位，在一侧开始转录，当到达损伤部位，就指示核苷酸切除修复蛋白结合而修复.3.直接修复（1）光复活 可见光激活该光复活酶 只有高等哺乳动物该功能退化掉了。例对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境。（2）去甲基4.重组修复 复制同时的修复提问：原损伤部位没有修复，对后代影响大吗？(在后代中只有一个个体含有该条DNA，后代越多，影响比例越小，等于消除影响。) 5.SOS修复DNA损伤严重，复制受到抑制，前几种方法难以奏效时：6. 断链修复转录：以DNA为模板合成RNA的过程不对称转录：以DNA一条链为模板转录RN

19、A的方式其中模板链（template strand）也叫反义链(antisense strand)与模板链互补的链为编码链（coding strand）叫正义链（sense strand）转录单位：DNA中指导转录一条RNA链的全部序列 DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。RNA聚合酶 底物：四种NTP 模板：局部解链的DNA单链 催化方式：按照碱基配对原则，将相应的NTP的5磷酸与上一个核苷酸的3 羟基形成3 5磷酸二酯键 合成方向：5 3 聚合反应不需要引物。能量：底物的高能键（2个）转录与复制的区别1.转录的底物是NTP，复制的底物是dNTP2.转录不需引物，复制需要引物3.转

20、录只维持转录区的RNA与DNA的双螺旋，结果是RNA单链；复制结果是形成新的DNA双螺旋4.转录精确度低于复制（10-4）5.转录是局部的，复制是整个分子6.一次转录可有1到几百甚至上千的拷贝。复制1次为两个拷贝。原核生物RNA聚合酶 结构：2细菌启动子由核心启动子和上游启动子元件（UP）组成。-35区（-35 box）：保守序列：TTGACA 功能：RNA聚合酶识别（因子）位点，对RNA聚合酶全酶有很高的亲和力 -10区（-10box）保守序列：TATAAT功能：RNA聚合酶紧密结合位点，决定转录方向，开始解链区s因子：小分子蛋白质，有ATP酶活性功能：识别核心启动子，使RNA聚合酶全酶结合

21、与启动子部位，并开始转录 上游启动子元件是由核心酶亚基的C端结合 s因子可增加全酶对DNA的特异结合，降低非特异性结合，保证转录起始的准确性原核生物转录 一起始1.搜索、结合启动子2.形成封闭复合物3.形成开放复合物4.形成三元复合物5.因子的解离 二延伸：因子从转录复合物的RNA聚合酶全酶脱落，转录进入延伸阶段。解螺旋和螺旋化是由RNA聚合酶催化的 产生的张力是由 拓扑异构酶释放的（三）终止：RNA聚合酶到达终止子则停止转录终止子能够使RNA转录停止的DNA序列。终止因子能够帮助终止子进行终止的蛋白质（NusA、NusB、NusENusG、因子）。终止的方式：强终子，弱终子终止子特点:富含G

22、、C的反向重复序列+ 6-8个A因子机理：结合于新合成的RNA链，借助水解ATP沿RNA 链运动，当RNA 聚合酶遇终止子停止，因子追上酶，水解ATP供给能量，从夺取与酶结合的RNA，使转录终止。真核生物RNA聚合酶有I、II、III三种（2）基本启动子 TATA（3）上游启动子元件GC框和CCAAT框(4)下游启动子元件转录因子（transcription factors,TF）RNA聚合酶催化的转录终止提出了两个模型Torpedo（鱼雷）model和Allosteric(变构) model内含子：DNA和pre-RNA中不出现在成熟RNA中的序列。RNA转录后加工方式：剪切、剪接、修饰、加

23、接内含子分类一类内含子（自我剪接内含子）：二类内含子：需蛋白质和酶参与剪接，主要存在于tRNA前体中。三类内含子：有snRNP（small nuclear ribonuclearproteins, 小分子核内核糖核蛋白）参与剪接的内含子，剪接时形成马套索结构。主要存在于真核核蛋白基因中。真核生物转录后翻译tRNA前体（pre-tRNA）的加工1.tRNA前体特点：各个tRNA前体是单顺反子，其基因是独立的转录单位。tRNA基因比原核生物多有内含子 （1）剪切与修剪（2）切除内含子（3）加CCA（4）碱基修饰rRNA前体的加工（1）剪切（2）甲基化3.snoRNA(small nucleolar

24、RNA,小分子核仁RNA)与蛋白质结合为snoRNP功能：指导rRNA甲基化，帮助rRNA形成高级结构mRNA前体（hnRNA）的加工 一 剪切剪接准确型的保证a.RNA聚合酶II结合有多个剪接蛋白，随着转录的进行，这些蛋白可以直接识别新合成的RNA剪接位点并与其结合。从而防止内含子逃脱。b.SR蛋白结合于ESEs（外显子剪接增强序列）处，与剪接体相互作用，引导剪接体结合于剪接位点二 5加帽子 加帽子的反应在hnRNA转录出约30个nt就开始 三3加尾巴 位于转录初始产物3上游500多nt 切割信号：加polyA位点上游20nt的专一序列四、RNA 的自我剪接 形成马套结构RNA编辑：改变RN

25、A编码序列的方式称为RNA编辑.RNA编辑的方式：插入、剔除、替换.RNA编辑的作用（1）调节基因表达（2）改变ORF（开放阅读框）纠正基因突变RNA的再编码（recoding）1. 校正tRNA校正tRNA：可以校正密码突变的tRNA。2.翻译移码（translational frameshifting）3.核糖体跳跃密码子或三联子密码(triplet coden) ：mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy）简并的作用：解释了为什么许多生物中，其DNA的A/T与G/C比例发生比较大的变化，但是蛋白质

26、中氨基酸的位置没有发生打的变化。简并的基础反密码的摇摆性：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摇摆”，这种现象称为密码子的摇摆性（wobble）。优点：减少由于碱基突变引起的蛋白质突变。普遍性与特殊性：蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体非编码序列：mRNA中不指导肽链合成的序列 编码序列（中间）：mRNA中直接指导肽链合成的序列。原核细胞mRNA的编码序列可指导几条肽链的合成，称为多顺反子mRNA (polycistrionic)真核细胞mRNA的编码序列只指导一条肽链的合成

27、，称为单顺反子mRNA (monocistrionic)密码阅读规律方向性：读码方向为5-3连续性：编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无重叠。框架性：读码方式是从起始密码子开始三个碱基、三个碱基连续读，每次读三个碱基的有读码方式称为阅读框，但是这三个碱基可以不是固定的，所以叫开放阅读框(open reading frame, ORF)移码突变（frame shift mutation）：由某一个核苷酸漏读、重读或者编码区插入、删除一个核苷酸就会使该处之后的读码发生错误而引起的突变核糖体结合位点（Ribosome binding site，RBS）原核生物：SD序列。

28、位于起始密码上游5-9个碱基，可以与核糖体小亚基16SrRNA3端序列碱基互补，从而与核糖体定位结合真核生物a.5帽子：小亚基在起始因子作用下，与帽子结合后，沿5-3 运动，直到AUG定位结合。b.Kozak序列：在AUG上下游，保证真正的起始密码AUG准确定位与P位，有时上游会出现AUG3-polyA尾巴：可促进核糖体有效循环tRNA的结构1.一级结构 二级结构：三叶草形 三级结构：倒“L”型tRNA的功能1、通过反密码子与密码子的碱基配对解读mRNA的遗传信息，一个tRNA可识别一个或几个密码子2、运输的工具，运载氨基酸3、约有近40种tRNAtRNA有两个关键部位：3端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。反密码子部位：mRNA反密码结合tRNA的种类1、起始tRNA和延伸tRNA真核细胞：tRNA携带的是甲硫氨酸（Met）表示：tRNAiMet原核细胞：tRNA携带的是甲酰甲硫氨酸（fMet）表示：tRNAfMet2、同工tRNA 3、校正tRNA核糖体的组成：原核30S和50S 真核40S和60S核糖体的rRNA既是结构成分，又是功能成分16SrRNA：结合定位mRNA23SrRNA：肽基转移酶活性核糖体有3个结合tRNA的活性位点 AA-tRNA结合位点（A位）肽酰-tRNA结合位点（P位）无荷载tRNA释放位点（E位）