细胞mRNA的提取

1、精选优质文档-倾情为你奉上技术方法名称 细胞mRNA的提取基本原理 一个典型的哺乳动物细胞含有约10-5 ug总RNA，其中8085%是核糖体RNA（主要有28S，18S，5.8S和5S四种）。剩余的1520%中大部分由不同的低相对分子量的RNA组成（如转运RNA和小核RNA）。这些高丰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量15%的信使RNA即mRNA无论大小还是序列都是相异，其长度从几百碱基到几千碱基不等，其实际含量也随着细胞类型的不同而不同，随细胞生理状态的变化而变化。在单个哺乳动物细胞中，大约有360,0

2、00个mRNA分子，12,000种不同的mRNA分子。有些mRNA在mRNA群体中的比例约为3%，而其它一些mRNA所占的比例则不超过0.01%。这些稀有或低丰度mRNA的拷贝数大约是每个细胞515个。然而，这些低丰度mRNA有11,000种，占mRNA群体的45%。在真核生物中，大部分mRNA（组蛋白除外）都是聚腺苷酸化的，其约200个腺苷酸残基构成的3尾部为分离真核mRNA提供了有效的方法。寡聚（dT）可以与poly（A）尾相结合，被用于回收mRNA。传统方法是将提取的总RNA（用酚-氯仿抽提细胞裂解液）通过寡聚（dT）纤维素柱来制备。但为了能将核酸酶造成的损伤降至最低，现在常采用一种更迅

3、速的方法即直接将结合着寡聚（dT）的磁珠加入到细胞裂解液中，再用强磁铁将磁珠吸出再洗出mRNA。某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物可以作为mRNA提取的替换途径。因为核糖残基在2和3位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶 具有水解核糖残基和磷酸间二酯键能力的酶切割。由于RNA酶从裂解的细胞中释放且存在于皮肤上，故要小心防止玻璃器皿、操作平台以及浮尘中RNA酶的污染。目前尚无使RNA酶失活的简易办法。链内二硫键的存在使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活，

4、因此难以被缓冲液中加入的EDTI或其他金属离子螯合剂失活。防止RNA酶最好的方法就是避免污染。提取细胞mRNA后，可通过mRNA翻译、凝胶电泳或Northern Blot分析来检测mRNA的完整性，通过紫外分光光度计来检测mRNA的纯度。用途及受限因素酶学研究 cDNA文库构建 RT-PCR S1核酶分析 引物扩增 核糖核酸酶保护 分子杂交 体外转录 差异显示 基因表达分析mRNA在细胞总RNA中的比例很低，需要大量的样本用于mRNA的提取，这就大大限制了稀有样本的检测。细胞mRNA的提取以Promega公司的PolyATtract System 1000为例基本原理任何一种RNA提取方法都包

5、括以下四个步骤：1）高效裂解细胞或组织；2）变性核蛋白复合物；3）灭活内源性的RNase活性；4）纯化RNA。所有这些步骤中最重要的是，立即灭活细胞裂解后从膜包围的细胞器中释放出的内源性RNase。用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。PolyATtract® System 1000利用硫氰酸胍（GTC）和-巯基乙醇来灭活细胞抽提液中的核酸酶，利用GTC和SDS来变性核蛋白复合物。核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来，使得RNA从溶液中释放出来，并与蛋白质分离。最终GTC的浓度允许mRNA的poly(A)与合成的生物素化的Oligo(dT)探针退

6、火，但仍能完全抑制细胞内的RNases。短暂的离心完成杂交，并去除细胞碎片和沉淀的蛋白质。离心后，用Streptavidin MagneSphere® Paramagnetic Particles (SA-PMPs)来捕获生物素化的Oligo(dT) : mRNA杂交分子。先用高严谨性的条件洗涤磁珠，然后用Nuclease-Free Water洗脱，便可获得纯化的mRNA。实验材料实验耗材 细胞刮子、微量移液器、量筒、烧杯、盐水瓶、止血钳、锡箔纸、药勺；进口Tip、Tube试剂 NaAc、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、无水乙醇、异丙醇等，均为分析纯，且最好是新的未开

7、封的； DEPC，焦碳酸二乙酯，购自Invitrogen公司；PolyATtract System 1000，Cat# Z5400购自Promega公司。实验前的准备（包括溶液的配制及无RNAase和DNAase环境的建立）1.无RNAase和DNAase环境的建立² 玻璃制品、铁制品、塑料制品和电泳槽 无菌的一次性使用的塑料制品（进口）基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。但为了保险起见，将它们装入无RNase和DNase的铁饭盒（干烤：300，4h），加0.1 焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡，37，至少2h，或室温下过夜。随后，高压蒸汽灭菌，15 psi

8、（1.05 kg/cm2），15 min。再烘干，100，23h。实验室用的普通玻璃器皿、铁制品和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于300 干烤4 h或更长时间（玻璃器皿、铁制品，若是敞口的器皿，需用锡箔纸封口后再干烤）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37放置小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100干烤15 min。在15 lbf/in2(1.034x105 Pa)高压蒸气灭菌15 min。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤

9、碱基进行修饰。 用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3的H2O2溶液，于室温放置10 min，然后用0.1DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。附 DEPCDEPC是具有高度活性的烷基化试剂，它通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase的酶活性。虽然DEPC是RNase的强烈抑制剂，但是它的作用并不是绝对的。在水溶液中，DEPC迅速水解为CO2和乙醇，在pH6.0的磷酸缓冲液中半衰期为20 min，在pH为7.0的磷酸缓冲液中为10 min。这种水解过程通过Tris和其它胺

10、类大大加速，它们自己本身也在这一过程中消耗了。因此，DEPC不能用来处理含有这些缓冲液的溶液。无亲核体（例如：水和乙醇）的DEPC样品是非常稳定的，但是甚至小量的上述溶质也能导致DEPC完全转化成碳酸二乙酯。由于这个原因，DEPC应该防潮，并小份储存于干燥的条件下，在开启瓶子前，应该使瓶子达到足够的温度。² 溶液的处理用干烤过的药匙称取试剂，用DEPC处理过的无菌去离子水溶解和稀释试剂，将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话，溶液均应用0.1DEPC于37至少处理12 h，然后于100加热15 min或在15 lbf/in2(1.034x105 Pa)的高压下蒸气灭菌15 min

11、。 DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。² 操作者及其操作环境RNase最主要的潜在污染源是操作者和灰尘。操作者应该戴一次性手套，并勤换手套；应该戴口罩和帽子，尽量不要对着RNA样品呼气或说话。灰尘中含有细菌和霉菌，所以应该保持操作环境整洁。对于多次使用的试剂，最好无菌操作。2.溶液的配制² 无DNase和RNase的去离子水将新鲜制备的去离子水装入干烤过的盐水瓶，加入DEPC，使其终浓度达到0.1%，振荡混匀后，置于37过夜。高压蒸汽蒸汽灭菌，15 lbf/in2(1.034x

12、105 Pa)，15 min。² 3M 醋酸钠溶液（100 ml）NaAc3H2O 40.81 g新鲜制备的去离子水 80 ml搅拌溶解后，用冰乙酸调pH至5.2，约需1.85 ml，再加去离子水调至100 ml。加入100 ul DEPC，振荡混匀后置于37过夜，然后高压蒸汽灭菌，15 lbf/in2(1.034x105 Pa)，15 min。² PBS（200 ml）NaCl 16 gKCl 0.4g Na2HPO4·12H2O 7.26 gKH2PO4 0.48 g用160 ml DEPC处理过的无菌去离子水溶解上述试剂，用浓HCl调pH至pH7.4，再用D

13、EPC处理过的无菌去离子水定容至200 ml。高压蒸汽灭菌，15 lbf/in2(1.034x105 Pa)，15 min。² 70%乙醇 采用DEPC处理过的无菌去离子水配制。² 无血清培养基1640 实验设计可以根据起始材料的量来确定试剂的用量。对于培养细胞，每次mRNA提取所用的细胞数量上下限分别为108和106。对于纯化的mRNA，则分别用紫外分光光度计测定数量和纯度，用凝胶电泳分析完整性。操作步骤及每步需注意的事项按照PolyATtract System 1000的protocol进行，并作了些修改，具体如下。1.收集细胞² 清洁工作 用干净纱布擦拭桌面

14、；用酒精棉球擦拭桌面、微量移液器、试管架、止血钳、磁架等；² 预热试剂将试剂盒中的下列组分取出置于桌面上，暖至室温。GTC Extraction Buffer、Biotinylated Oligo(dT) Probe、Nuclease-Free Water、SSC（0.5×）² 洗涤细胞 先用无血清培养基1640洗涤细胞，10 ml/T75瓶/次，共3次。² 刮细胞 每个培养瓶中分别加入6 ml 1640，用细胞刮子刮下细胞，注意培养瓶的四个角。镜检判断是否还有残余细胞。将刮下的细胞连同1640转移至50 ml离心管。用1640洗涤培养瓶，以回收残留在培

15、养瓶中的细胞，尽量减少损失。1640的用量为：6 ml/5瓶。然后将液体与上一步合并。² 洗涤细胞 离心，1,500 rpm，10 min。去上清，加入预冷的PBS，轻轻重悬细胞沉淀，并使细胞完全分散。离心，1,500 rpm，10 mim，去上清，备用。期间，预热Dilution Buffer至70。2.裂解细胞 在一个新的无RNase和DNase污染的50 ml离心管中混和4 ml GTC Extraction Buffer和164 ul -巯基乙醇。Vortex混匀后加到含细胞沉淀的50 ml离心管中，高速Vortex至细胞完全裂解。3.探针退火² 在一个新的无RNa

16、se和DNase污染的50 ml离心管中分别加入8 ml 70预热的Dilution Buffer和164 ul -巯基乙醇。Vortex混匀后加到细胞裂解液中，上下颠倒混匀。² 加入10 ul Biotinylated Oligo(dT) Probe，混匀后70水浴5 min。² 将裂解液转移至12个1.5 ml eppendorf管中，室温下离心，12,000 rpm，10 min（离心前平衡离心机温度至室温。在室温下离心目的是避免溶液中的盐分和去污剂的析出）。² 将上清分别转移至12个新的1.5 ml eppendorf管中，室温下离心，12,000 rpm

17、，10 min。4.洗涤偶联有链霉亲和素的磁珠SA-PMPs可以安排在步骤3中的离心期间进行。² 轻摇瓶子，使SA-PMPs完全重悬。² 转移6 ml SA-PMPs至一个新的RNase Free的50 ml离心管中，将离心管置于磁架上，慢慢放平。待磁珠完全聚集到管子一侧时，小心倒掉储存缓冲液。² 加入6 ml 0.5×SSC重悬SA-PMPs，磁架捕获后倒掉上清，具体作法同上一步。² 重复洗涤步骤2次，即洗涤3次，然后加入6 ml 0.5×SSC重悬SA-PMPs。5.捕获和洗涤磁珠² 当步骤3完成后，小心转移上清至洗涤过

18、的SA-PMPs中，上下颠倒混匀。注：勿吸沉淀。吸到沉淀会导致整个系统的效能。² 室温下孵育10 min。² 用磁架捕获SA-PMPs，将上清转移至一个新的RNase Free的50 ml离心管中，冰浴保存至确认有满意的结果为止。² 用1.8 ml（分两次，第一次用1 ml，第二次用0.8 ml）0.5×SSC重悬SA-PMPs并转移至一个2 ml mRNA User Tube中。用磁架捕获磁珠后，用微量移液器小心地移去上清。² 重复洗涤4次，即共洗涤5次。最后一次洗涤完成后，尽可能地移去上清，但不扰动SA-PMPs。注：洗涤时应远离磁架，同时

19、应上下颠倒2 ml mRNA User Tube以达到充分洗涤SA-PMPs为止。6.洗脱mRNA² 加入总量为1 ml的RNase Free Water，上下颠倒数次后，室温下孵育3 min。用磁架捕获SA-PMPs后，将上清转移至2个1.5 ml eppendorf管中，每管0.5 ml，分别编号为1，2。² 重复上一步骤一次，eppendorf管的编号分别为3，4。² 往2 ml mRNA User Tube中加入1 ml RNase Free Water，冰浴保存至mRNA产量和纯度的测定完成为止。7.沉淀mRNA² 往1，2，3，4号eppen

20、dorf管中分别加入50 ul 3 M NaAc和500 ul 异丙醇，上下颠倒混匀后，-20沉淀过夜。² 4下离心，13,000 rpm，25 min。离心完成后，看不到沉淀，但磁珠可指示沉淀的位置。² 沿着与沉淀面相背的一侧吸出上清。注意勿吸丢沉淀。² 分别加入1 ml 70%乙醇。注意：用微量移液器轻轻而又缓慢地将70%乙醇从与沉淀面相背的一侧加入。² 4下离心，13,000 rpm，25 min。² 沿着与沉淀面相背的一侧缓慢地将70%乙醇吸去。注意勿吸丢沉淀。² 室温下晾干。注意：沉淀不能太干，否则可能难溶解。²

21、用5 ul RNase Free Water溶解沉淀。溶解沉淀时，用微量移液器反复吸放，以达到充分溶解的目的。8.紫外分光光度计测定mRNA的数量和纯度9.琼脂糖凝胶电泳分析mRNA的完整性10.mRNA的保存短期保存（<30 d）：以0.5-1.0 mg/ml的浓度溶解在水中，并保存于-70。长期保存（>30 d）：将RNA沉淀保存在70%乙醇中，置于-70。结果观察及分析的原则1）紫外分光光度计测定mRNA的数量和纯度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。对于纯净的样品，A320一般是0，A260 / A230 的比值大于2.0。若A260 / A230小于2，则表明样品中仍存在GTC或-巯基乙醇。对于A260 / A280（Ratio，R），当R>1.82时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定要不要使用这份RNA（不同的实验对RNA质量的要求不同）。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。测定mRNA的纯度