目的基因(COR)转入受体细胞的方法及检测

1、精选优质文档-倾情为你奉上目的基因（COR）转入受体细胞的方法及检测学生：魏烈斌 指导老师：高海宁(河西学院农业与生物技术学院 甘肃 张掖 ）摘要： 利用PGEMT -easy质粒为载体，用CaCl2法制备感受态细胞，把人工合成的抗氨苄青霉素的基因导COR基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的选择培养基筛选出含有抗氨苄青霉素基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌用碱裂解法进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切凝胶电泳图的分析。用EcoRI酶进行酶切研究。结果表明：人工合成的抗氨苄青霉素的基因在大肠杆菌中跟随质粒的复制进行同步复制并通过大肠杆菌自身的表达系统表达出了抗氨苄青霉素的产物，使大

2、肠杆菌能在含氨苄青霉素的LB培养基上正常生长。关键字： PGEM-Teasy质粒 抗氨苄青霉素 氯化钙法 大肠杆菌 引言：在DNA体外重组技术的研究和应用中，转化是个很重要的步骤。自Cohen等人在1972年首次用CaCl2：处理的方法成功地进行了R因子对E. colt C600的转化之后，这个方法一直广泛地应用于大肠杆菌各受体菌系的转化。鼠伤寒沙门氏杆菌S. typhimurium和金黄色葡萄球菌S. aureus，的转化也都沿用此法。直至1978年，Michael等在用pBR 322质粒DNA对E. colt X1776的转化中却采用了与此不同的方法。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.

3、1 供试材料：大肠杆菌（实验室提供） PGEM-Teasy质粒 Taq酶1.1.2 仪器：基因扩增仪 移液器 电泳仪 紫外检测仪 恒温摇床 恒温水浴器 恒温培养箱 低温离心机 超净工作台 冰箱 离心管 小指管 1.1.3 试剂： PCR缓冲液(含Mg+) 4种dNTP Taq酶 DNA模板两种引物（正向引物和反向引物） EB溶液 氯化钠(Nacl) 氨苄青霉素 氯化钙(CaCl2) 酒精灯 牙签 LB液体培养基 ddH2O 溶液（50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA） 溶液 0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等体积混合

4、 溶液 5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去离子水。 Tris.HCl RNase 溶液 1.2 方法1.2.1 PCR基因扩增1.2.1.1 按顺序向微量离心管中依次加入：模板DNA 1l 10×PCR 缓冲液 2.5ldNTP 2.0l 引物I 0.5l 引物 0.5l Taq酶 1l加ddH2O 至25l混匀。 1.2.1.2 PCR反应参数 (1) 94预变性 2min (2) 94变性 1min (3) 55退火 1min (4) 72 延伸 2min。 (5) 重复(2)-(4) 35次（6）72 延伸 10min。（7）4保存

5、1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10l PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。1.2.2 DNA重组重组体系：T4DNA ligase 10lPGEM-T-easy 0.5lBuffer 1.0lDNA 7.5l在此重组体系中进行重组，1416条件下恒温培养8 h 12 h。即得到重组质粒。1.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1.2.3.1从新灭活的E.coli DH5菌株平板上挑取一个单菌落接于3mlLB液体培养基试管中， 37振荡过夜。1.2.3.2取0.5ml 过夜培养液，接种于50ml LB液体培

6、养基中，37振荡培养2-3h，至OD600<=0.4-0.5时，放置于4冰箱冷却1-2h。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）1.2.3.3取1ml培养液装入1.5ml离心管中，在冰上冷却10-30min于4离心，4000r/min离心10min。（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）1.2.3.4 倒尽上清液，用冰浴的0.1mol/LCaCl2 200µl悬浮，立即置于冰上冰浴30min。0-4离心，4000r/min×10min。1.2.3.5弃去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl2 200l悬浮于冰上20-30min。4离心，4000r/mi

7、n×10min。1.2.3.6弃去上清。加入冰浴的0.1mol/LCaCl2 20µl，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后即成转化态细胞。1.2.3.7给上述感受态细胞中加入连结体系（共100ml）1.2.3.8将以上样品轻轻混匀，冰上放置20-30min。1.2.3.9于42热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴1-2min1.2.3.10向上述管中加入800 -900m l LB培养液，使总体积到达1ml，摇匀后于37震荡培养45-60min,使受体菌株恢复到正常状态，并使转化体表达抗生素基因产物。1.2.3.11取上步转化细胞200l涂布于LB固体培养基（含Amp 5mg

8、/ml）,37恒温培养8-12h。1.2.4质粒DNA的提取及酶切1.2.4.1 提取质粒1.2.4.1.1 先在3ml液体培养基上加入3mlAmp然后接入一个含有PETBlue-2质粒的大肠杆菌但菌落，37震荡培养过夜。 1.2.4.1.2 取过夜的培养物1.5ml倒入小离心管中8000r/min离心2min。吸去培养液。1.2.4.1.3加100l（5 mg/ml 溶菌酶）溶液，颠倒混匀使菌体悬浮。1.2.4.1.4 加200l的溶液（新鲜配置），轻轻混匀，冰浴2-3 min。 1.2.4.1.5 加150l的溶液，点到混匀，冰浴3-5 min让质粒DNA复性。1.2.4.1.6 1200

9、0r/min，离心10min，将上清转至另一离心管中。1.2.4.1.7 向上清液中150µl 酚：氯仿：异戊醇（24：1：1）（去蛋白和脂质），反复混匀，12000r/min，离心10min，将上清转至另一离心管中。1.2.4.1.8吸取上清，加2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置2-510min。 12000 r/min离心15 min。倒去上清液。1.2.4.1.9 用400l70乙醇洗涤质粒DNA沉淀，8000r/min离心20 min吸去上清液，空气中干燥。1.2.4.1.10加20lTE（RNAsea），使质粒DNA完全溶解，-20保存。1.2.4.2 质粒P

10、CR把提取出来的质粒DNA在60下煮10min或加RNA酶除去样品中的RNA，然后取1 ul质粒DNA样品再加24ul的PCR体系放入PCR仪内进行PCR扩增。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.4.2 酶切取5.5l质粒DNA样品加4.5l酶切体系后用37下恒温水浴过夜即得到酶切质粒DNA。然后再进行琼脂糖凝胶电泳分析。2 结果与分析2.1 PCR目的基因的扩增电泳图的分析20001000750500250100 Marker 5 图1 目的基因PCR扩增产物凝胶电泳图由上图可以看出，目的基因的含有1000bp个碱基对，扩增后的DNA分子浓度大大提高，扩增效果良好，达到了扩增的目的。2

11、.2 重组后的质粒导入大肠杆菌后在含氨苄青霉素的培养基上生长的分析 图2含有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌平板受体细胞经过氯化钙法处理后，使大肠杆菌细胞膜通透性发生了暂时性的改变，能容忍DNA重组后的质粒DNA导入感受态细胞。导入受体细胞的DNA分子通过复制表达实现信息的转移，使受体细胞在含AmpLB培养基上培养，即可筛选出含有质粒DNA的大肠杆菌。由图2看出利用Cacl2法制备大肠杆菌感受态细胞在导入重组DNA质粒后，在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明导入的目的基因跟随质粒的复制发生了大量的复制，并通过大肠杆菌的表达系统对氨苄青霉素抗性基因进行了表达。2.3重组质粒琼脂糖凝胶电泳图的分析25

12、05007501000 Marker 3 图3质粒琼脂糖凝胶电泳图 由上图可看出在Marker20003000处有一条较亮的带就是质粒，说明质粒提取成功，且是插入目的基因的重组质粒。但由电泳图中杂带太多可看出提取的质粒样品中杂质太多，上面有较长拖拉的那条带应该是大肠杆菌自身的RNA，最下面分子量较大的杂带可能是大肠杆菌自身的双螺旋DNA分子。可以考虑进一步对所采用的质粒提取的方法进行改进以达到更好的效果。2.4质粒PCR的电泳图的分析10025050075010002000 Marker 3 图4质粒PCR琼脂糖凝胶电泳图 提取出来的质粒样品经过PCR扩增后与图3中的质粒相比DNA量和纯度大大

13、增加，效果很好，说明PCR扩增是低浓度DNA样品由高浓度DNA样品的必经过程。进一步说明目的基因成功被导入了大肠杆菌细胞中，并在体内进行了大量的复制。产生了大量的重组质粒的复制子。2.5质粒酶切的电泳图的分析25050075010002000 Marker 3 图5质粒酶切琼脂糖凝胶电泳图 由上图可看出共有三条带，从上往下分别代：表质粒被完全酶切得到的目的基因片段、没被酶切的完整质粒和质粒被部分酶切得到的开环质粒。大部分质粒都被部分酶切变成了开环质粒。说明重组质粒量很多且样品的纯度较高，提取效果较好。3讨论 该文中采用常规的感受态细胞制备的方法为氯化钙法，此法制备大肠杆菌感受态细胞成本低，方法

14、简便，对实验操作的要求也比较低且效果也很好。质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞是分子生物学中非常重要的常规操作之一，其转化效率的高低与感受态细胞有关。 对质粒DNA提取采用常规方法提取，对蛋白质抽提并未省去，这种方法所提取的质粒DNA均能够被酶切开，此方法可以用在后续的酶切、连接和转化等分子生物操作。 以目的基因为模板，在PCR仪内进行扩增后，对扩增产物进行凝胶电泳后发现在1000bp处的条带比较清晰，说明目的基因的分子量在一千左右。对提取出来的重组质粒酶切后进行琼脂糖凝胶电泳后发现重组质粒在Marker 3000-4000处，由于Marker是线性分子，所以进一步判断重组质粒大概含有4000bp的碱基。从而说明空质粒载体含有的碱基大概是3000bp，这与图3中对质粒进行凝胶电泳后的结果一致。参考文献1金东雁等译，分子克隆实验指南M.北京：科学出版社，2003:362-3922杨坤，巩振辉，李大伟. 大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立.北方园艺 ，2010（14）3陈绍兴, 李沁