实验6-淀粉酶的固定化

1、第二章第二章 酶的应用酶的应用实验实验6 -淀粉酶的固定化及淀粉淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测水解作用的检测什么是酶制剂？什么是酶制剂？蛋白酶和脂肪酶蛋白酶和脂肪酶酶制剂：酶制剂：含有酶的制品。含有酶的制品。胃蛋白酶胃蛋白酶酶制剂的缺点酶制剂的缺点u通常对通常对强酸、强碱、高温强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏和有机溶剂等条件非常敏感，感，容易失活容易失活。u溶液中的酶很溶液中的酶很难回收难回收，不能被再次利用不能被再次利用，提高了生，提高了生产成本。产成本。u反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量（反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量（难分难分离离）。）。什么是固定化酶？什么是固定

2、化酶？固定化酶：固定化酶：将将水溶性的酶水溶性的酶用用物理或化学物理或化学的方法固定在的方法固定在某某种介质种介质上，使之成为上，使之成为不溶于水不溶于水而又有而又有酶活性酶活性的制剂。的制剂。酶的固定化方法酶的固定化方法吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法包埋法包埋法共价偶联法共价偶联法交联法交联法包埋法包埋法实验原理实验原理用用吸附法吸附法将将-淀粉酶淀粉酶固定在固定在石英砂石英砂上，一定浓度的上，一定浓度的淀淀粉溶液粉溶液经过经过固定化酶柱固定化酶柱后，可使淀粉水解成后，可使淀粉水解成糊精糊精，用，用淀粉指示剂溶液（淀粉指示剂溶液（KI-I2溶液溶液）测试，流出物呈）测试，流出物

3、呈红色红色表表明水解产物糊精生成。明水解产物糊精生成。糊精糊精淀粉淀粉-淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶麦芽糖麦芽糖葡萄糖葡萄糖糖化淀粉酶糖化淀粉酶遇碘显红色遇碘显红色遇碘不显色遇碘不显色遇碘显蓝色遇碘显蓝色实验设备及用品实验设备及用品5mL塑料注射器塑料注射器、 50mL烧杯、滴管、烧杯、滴管、自行车用气门心及自行车用气门心及夹子夹子、注射器架、试管及微量离心管、注射器架、试管及微量离心管3支。支。固定化柱固定化柱控制流速控制流速注射器架注射器架阀门阀门Step1：-淀粉酶的固定化淀粉酶的固定化吸附：吸附：5mg-淀粉酶淀粉酶+4mL蒸馏水蒸馏水+5g石英砂石英砂，搅拌搅拌30min。装柱：装柱：装

4、入下端接有气门心并装入下端接有气门心并用夹子封住用夹子封住的注射器中。的注射器中。 洗柱：洗柱：用用10倍柱体积倍柱体积的的蒸馏水洗涤蒸馏水洗涤除去除去未吸附的游离淀粉酶未吸附的游离淀粉酶。吸附有吸附有-淀粉淀粉酶的石英砂酶的石英砂固定化装置固定化装置反应柱反应柱固定化柱固定化柱控制流速控制流速注射器架注射器架Step2：淀粉水解作用的检测：淀粉水解作用的检测溶解淀粉：溶解淀粉：50 mg 可溶性淀粉可溶性淀粉溶于溶于100 mL热水中，热水中，搅拌均匀搅拌均匀。过柱：过柱：使淀粉溶液以使淀粉溶液以0.3 mL/min的流速的流速过柱过柱，在流出，在流出5mL淀粉溶液后接收淀粉溶液后接收0.5

5、 mL流出液。流出液。检测：检测：加入加入1-2滴滴KI-I2溶液溶液，观，观察颜色变化。用水察颜色变化。用水稀释稀释1倍后再观倍后再观察颜色。察颜色。每分钟每分钟6滴滴Step3：固定化柱的保存和再次使用：固定化柱的保存和再次使用用用10倍柱体积的蒸馏水倍柱体积的蒸馏水洗涤洗涤此柱（此柱（洗去残留的反应物和洗去残留的反应物和产物产物），放置在），放置在4冰箱中保存，几天后取出再重复实验。冰箱中保存，几天后取出再重复实验。实验结果实验结果对照：淡黄色对照：淡黄色蓝色蓝色红色红色浅红色浅红色实验结论：淀粉被实验结论：淀粉被-淀粉酶水解成为糊精。淀粉酶水解成为糊精。水水淀粉淀粉溶液溶液淀粉淀粉滤液

6、滤液稀释稀释1倍倍固定化酶柱固定化酶柱目的：控制流速让淀粉和淀粉酶充分接触反应。目的：控制流速让淀粉和淀粉酶充分接触反应。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。入。固定化酶技术生产高果糖浆固定化酶技术生产高果糖浆分布着小孔的筛板分布着小孔的筛板例题：例题：研究认为，用研究认为，用固定化酶技术固定化酶技术处理污染物是很有前途处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的的。如将从大肠杆菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制上制成制剂，可以用来成制剂，可以用来降解残留在土壤中的有机磷农药降解残留在土壤中的有机磷农药，与用

7、，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的（微生物降解相比，其作用不需要适宜的（ ）A. 温度温度 B. pHC. 水分水分 D. 营养营养固定化酶的优点：固定化酶的优点：使酶既能使酶既能与反应物接触与反应物接触，又，又能与产物分离能与产物分离。固定在载体上的固定在载体上的酶可酶可以被以被反复利用反复利用。酶反应过程可酶反应过程可严格控制。严格控制。例题：（例题：（2013杭州模拟）杭州模拟）（1）在工业生产中，为提高酶）在工业生产中，为提高酶的使用效率和产品纯度，一般需要将的使用效率和产品纯度，一般需要将酶进行固定化酶进行固定化处理。处理。利用利用石英砂石英砂固定固定-淀粉酶的方法属于（淀粉酶

8、的方法属于（ ）A. 吸附法吸附法B. 偶联法偶联法C. 交联法交联法D. 包埋法包埋法（2）一定浓度的淀粉溶液流过）一定浓度的淀粉溶液流过-淀粉酶淀粉酶固定化酶柱固定化酶柱后，被后，被水解成水解成，遇碘显，遇碘显色。色。（3）-淀粉酶可以通过淀粉酶可以通过枯草杆菌发酵枯草杆菌发酵生产，以下是利用生产，以下是利用诱诱变育种变育种方法培育获得方法培育获得产生较多淀粉酶产生较多淀粉酶的菌株的主要实验步的菌株的主要实验步骤。（骤。（原理：原理：菌株生长过程中可释放淀粉酶分解培养基中菌株生长过程中可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成的淀粉，在菌落周围形成透明圈透明圈。）。）糊精糊精红红第一步

9、：将枯草杆菌菌株第一步：将枯草杆菌菌株接种接种到到培养基上进行培养基上进行扩扩大培养大培养。第二步：将枯草杆菌菌株分成两组，第二步：将枯草杆菌菌株分成两组，A组用组用处理，处理，B组组不处理（作对照）。不处理（作对照）。第三步：制备多个第三步：制备多个含淀粉的固体培养基含淀粉的固体培养基。第四步：将第四步：将A、B组组分别稀释分别稀释后，分别在含淀粉的固体培养后，分别在含淀粉的固体培养基上利用基上利用法分离，适宜条件下培养得到法分离，适宜条件下培养得到单菌落单菌落。第五步：观察第五步：观察A、B组各菌落周围的组各菌落周围的 。实验结果预期：实验结果预期：根据诱发根据诱发突变率低突变率低的特点，

10、预期的特点，预期。根据诱发根据诱发突变不定向突变不定向的特点，预期的特点，预期。液体液体诱变剂诱变剂涂布涂布透明圈大小透明圈大小A组多数菌落周围的透明圈与组多数菌落周围的透明圈与B组差异不显著组差异不显著 A组透明组透明圈大小不一，圈大小不一，B组较一致组较一致例题：（例题：（2013浙江自选模块）浙江自选模块）利用利用紫甘薯制酒紫甘薯制酒可提高其可提高其附加值。请回答：附加值。请回答：（1）为提高紫甘薯的利用率，工厂化生产时，可加入）为提高紫甘薯的利用率，工厂化生产时，可加入果果胶酶和淀粉酶胶酶和淀粉酶，其中果胶酶可来自，其中果胶酶可来自等等微生物微生物。由于酶在水溶液中不稳定，因此常将酶固

11、定在由于酶在水溶液中不稳定，因此常将酶固定在某种介质某种介质上上制成制成。（2）果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶水解成）果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶水解成。A. 半乳糖醛酸和葡萄糖半乳糖醛酸和葡萄糖B. 半乳糖和果糖半乳糖和果糖C. 半乳糖醛酸甲酯和果糖半乳糖醛酸甲酯和果糖D. 半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯黑曲霉或苹果青霉黑曲霉或苹果青霉固定化酶固定化酶（3）紫甘薯匀浆流经）紫甘薯匀浆流经-淀粉酶柱淀粉酶柱后，取适量流出的液体，后，取适量流出的液体，经经脱色脱色后加入后加入KI-I2溶液溶液，结果液体呈，结果液体呈红色红色。表明该液体中。表明该液体中含有含有。 A. 淀粉淀

12、粉B. 糊精糊精C. 麦芽糖麦芽糖D. 葡萄糖葡萄糖（4）在发酵前，为使）在发酵前，为使酵母菌酵母菌迅速发生作用，取适量的干迅速发生作用，取适量的干酵母，加入酵母，加入温水温水和和。一段时间后，酵母悬液中。一段时间后，酵母悬液中会出现会出现气泡气泡，该气泡内的气体主要是，该气泡内的气体主要是。将酵母液。将酵母液接种到待发酵液中后，随发酵的进行，酵母菌在接种到待发酵液中后，随发酵的进行，酵母菌在条件下产生了条件下产生了酒精和二氧化碳酒精和二氧化碳。蔗糖蔗糖CO2无氧无氧（5）下图表示）下图表示发酵液发酵液pH对对酒精浓度酒精浓度的影响。据图判断，的影响。据图判断，最佳最佳pH是是。4.7例题：（

13、例题：（20132013宁波模拟）宁波模拟）固定化酶固定化酶是从是从20世纪世纪60年代迅年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重双重固定法固定法，即采用，即采用戊二醛作交联剂戊二醛作交联剂（使酶相互连接），（使酶相互连接），海藻海藻酸钠作为包埋剂酸钠作为包埋剂来来固定小麦酯酶固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。如图显示的是部分研究并对其最佳固定条件进行了探究。如图显示的是部分研究结果（注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包结果（注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活

14、性和酶的数量），分析并回答：括酶活性和酶的数量），分析并回答：（1）固定化酶技术固定化酶技术是将水溶性的酶用物理或化学的方法是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使酶既能与固定在某种介质上，使酶既能与接触，又能与接触，又能与 分离，同时还能被分离，同时还能被。常见的。常见的酶固定化的方酶固定化的方法法有多种：如对本题的小麦酯酶使用了有多种：如对本题的小麦酯酶使用了 和和，在，在“-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测的检测”这一实验中，这一实验中，-淀粉酶固定在淀粉酶固定在石英砂石英砂上，使用了上，使用了下图中的下图中的。底物（反应物）底物（反应物）产物产物反复利用反复利用交联法交联法包埋法包埋法（2）从对）从对温度变化适应性和应用范围温度变化适应性和应用范围的角度分析，甲图所的角度分析，甲图所示结果可以得出的结论是示结果可以得出的结论是。（3）乙图曲线表明浓度为）乙图曲线表明浓度为 的海藻酸钠包埋效果最的海藻酸钠