酵母菌DNA的提取

1、精选优质文档-倾情为你奉上酵母DNA提取方法 方法一：石英砂法1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于 200L 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入 3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡 13min，每隔 4min 将离心管取出用力甩几下，然后 65水浴 10min。2、加入 200L 5mol/L KAc，冰浴 8min；3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中；4、加入 3 mol/L NaAc 35l，加入异丙

2、醇 200L混匀后冰浴 8min，12000rpm×5min收集沉淀；5、200L TE 溶解，加入 RNase10L，65水浴 10min；6、加入 200L 氯仿异戊醇（24:1）,抽提；7、温柔地取上清 150L ，加入 20L 3 mol/L NaAc 及 375L 无水乙醇，混匀后12000rpm×8min 收集 DNA；8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后 TE 溶解，-20保藏。方法二：蜗牛酶法1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在25-28振荡培养12-16 h。2. 3500 rpm离心5min沉淀细胞，用1ml 的无菌水洗涤一次，再加0.5ml solut

3、ion (1M 山梨醇，0.1M EDTA, pH=7.5)重悬。3. 转移细胞至1.5 ml 的离心管中，加入0.1蜗牛酶 (30mg/ml)溶液，37保温30-60min, 以获得原生质体。4. 最大转速离心1min以沉淀细胞，用500ulsolution(50mMTris-HCl, 20mM EDTA,pH=7.4)溶液悬浮，然后加入50l 10% SDS, 混合65保温30min。5. 加入200l 5M 醋酸钾，放于冰上30 min。6. 最大转速离心15min，转移上清液至新的离心管中，用等体积的异丙醇沉淀DNA。7. 室温下放置5min，离心10min，用70%的乙醇洗涤一次，真

4、空干燥，用50ul pH=7.4 TE溶液溶解。 方法三：蜗牛酶过夜处理法将酵母接种到YPD培养基中30过夜培养1618h，离心收集1.5mL，用灭菌水洗涤两次；加入600L裂解液，35L蜗牛酶，37消化过夜；加入饱和酚450L，氯仿-异戊醇(体积比24:1)150L，轻轻颠倒混匀使溶液成为乳状，并保持10min，3000r/min离心10min；吸取上清液，用氯仿-异戊醇(体积比24:1)450L再抽提1次，10000r/min离心5min；取上清加入异丙醇800L，20静置30min；10000r/min离心5min，沉淀物用70%乙醇洗两次，自然干燥后溶于30L TE

5、缓冲液；加入0.5L10mg/mL的RNaseA，37温浴30min，自然冷却后保存。 方法四：蜗牛酶反复冻融法收集过夜培养1618h的菌体1.5mL，加入500LPBS溶液重悬菌体，12000r/min离心2min，用PBS重洗一次；将沉淀溶于35L的蜗牛酶溶液中，加入65L的PBS，45作用2h，加100L裂解液，20冷冻，然后室温振荡溶解，反复3次；向悬浮液中加入150L 5mol/L KAc(pH8.9)轻轻混匀，然后10000r/min离心5min；取上清液，加入两倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min；12000r/min离心10min，将沉淀溶

6、解在100L TE中；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，轻柔颠倒混匀，12000r/min离心5min，重复抽提1次；加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，20放置30min；10000r/min离心5min，弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤沉淀两次，室温干燥后用20L TE溶解；加入0.5L 10mg/mL的RNaseA，37温浴30min，自然冷却后保存。 方法五：溶解在100L TE中；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，轻柔颠倒混匀，12000r/min离心5min

7、，重复抽提1次；加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，20放置30min；10000r/min离心5min，弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤沉淀两次，室温干燥后用20L TE溶解；加入0.5L 10mg/mL的RNaseA，37温浴30min，自然冷却后保存。 方法六：1、配一个破菌缓冲液：Triton X-100        2%（v/v）        SDS       1%（w/v）NaCl 

8、       100mM       Tris-HCl（pH 8.0）       10mM2、把酵母细胞离心收集，加200ul的石英砂或玻璃珠，加入200l的破菌液再加200l的酚氯仿，涡旋一分钟，放在冰上一分钟，一共反复4次3、加入500l的ddH2O，涡旋，离心，抽上清和等体积的酚氯仿混合4、涡旋，离心，抽上清和等体积的酚氯仿混合，重复4直到离心后两层之间没有蛋白出现5、抽上清加1ml的无水乙醇，放在-20度30min6、离心，抽上清，再用70%乙醇洗一次，真空干燥，用TE或dd

9、H20溶解 方法七：接种酵母到2.5ml 酵母试管培养基中(YPD培养基)， 30，培养1618h；取1.5ml 酵母培养液，室温下， 1500 × g 离心510min 收集菌体；菌体用灭菌水洗1 次， 1500 ×g离心5min；菌体用200l SCED(1mol/L 山梨醇、 10mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/LEDTA、10mmol/L DTT 二硫苏糖醇)溶液重悬，加入3 0l 10mg/ml 溶菌酶(Lysozyme)37温浴1h；加入100l 2%SDS 混匀，-20冰冻，然后室温震荡溶解，反复3 次；向悬浮液中加入150l 5mol/L KAc(pH 8.9)轻轻混匀，然后10000r/min 离心5min；将上清转移到一新的1.5ml 离心管中，加入 2 倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置5min 后12000r/min 离心10min；除去上清，将沉淀溶解在300l TE(10mmol/L Tris-HCl，pH7.4，1mmol/L EDTA，pH8.0) 中，加入 6l RNase (10mg/ml)，37温浴30min；加入饱和酚和氯仿各150l 充分混匀，然后10000r/min离心5min；转移上清到新的1