第十章青岛科技大学

1、第十章第十章甾体激素类药物甾体激素类药物的分析的分析返回主目录2008北京奥运兴奋剂检查数量北京奥运兴奋剂检查数量4500例，阳性例，阳性9例例 基基 本本 要要 求求1 1掌握本类药物常用的鉴别试验和特殊杂质掌握本类药物常用的鉴别试验和特殊杂质的检查方法。的检查方法。2 2掌握高效液相色谱法、紫外分光光度法、掌握高效液相色谱法、紫外分光光度法、四氮唑比色法、异烟肼比色法、四氮唑比色法、异烟肼比色法、KoberKober反应比反应比色法色法等含量测定方法。等含量测定方法。3 3熟悉本类药物的化学结构、特征官能团与熟悉本类药物的化学结构、特征官能团与分析方法的关系。分析方法的关系。返 回基本结构

2、：环戊烷骈多氢菲基本结构：环戊烷骈多氢菲C20C21ABCD12345678910111213141516171819 概述概述分类：分类：甾体激素甾体激素肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素性激素性激素雄性激素及蛋雄性激素及蛋白同化激素白同化激素孕激素孕激素雌激素雌激素OHOOHOCH2OHHHH 肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素氢化可的松氢化可的松4 433酮酮基基C C1717醇酮基醇酮基OHOOHOHFHOCH3OHCH3肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素醋酸地塞米松醋酸地塞米松OHOHCH3HHHHOFCH3OOPONaOONaOH肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠雄性激素雄性激

3、素OCH3HHCH3OHHCH3甲睾酮甲睾酮OOHHHHOCH3雄性激素雄性激素丙酸睾酮丙酸睾酮OOHHHHO蛋白同化激素蛋白同化激素苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙孕激素孕激素黄体酮黄体酮OCH3HHHCH3OHCH3C C1717- -甲酮基甲酮基OCH3HHCH3OOHCH3OCH3CH3孕激素孕激素醋酸甲地孕酮醋酸甲地孕酮雌性激素雌性激素炔雌醇炔雌醇OHCH3HHHCCHHO雌性激素雌性激素OHCH3HHHHHO雌二醇雌二醇OHOHHHCH3HCCH炔诺酮炔诺酮此外此外OHOHHHH3CHCCH炔诺孕酮炔诺孕酮返 回一、结构与性质一、结构与性质 1. 1. 肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素主要活性基团

4、主要活性基团性性 质质4 433酮酮UVUV、与羰基试、与羰基试剂反应剂反应 C C1717醇酮基醇酮基还还 原原 性性2. 2. 雄性激素及蛋白同化激素雄性激素及蛋白同化激素主要活性基团主要活性基团性性 质质4 433酮酮UVUV、与羰基试、与羰基试剂反应剂反应 C C1717羟基羟基可成酯可成酯3. 3. 孕激素孕激素主要活性基团主要活性基团性性 质质4 433酮酮UVUV、与羰基试、与羰基试剂反应剂反应C C1717甲酮基甲酮基与亚硝基铁氰与亚硝基铁氰化钠反应化钠反应4. 4. 雌性激素雌性激素主要活性基团主要活性基团性性 质质A A环为环为33OH OH 苯环苯环UVUV、与重氮苯磺、

5、与重氮苯磺酸盐反应酸盐反应C C17 17 乙炔基乙炔基与与AgNOAgNO3 3反应反应C C1717羟基羟基可成酯可成酯返 回二、鉴别试验二、鉴别试验1、物理常数测定、物理常数测定按照按照Ch.PCh.P的熔点测定法进行的熔点测定法进行 第一法：用于测定易粉碎的固体药物第一法：用于测定易粉碎的固体药物 第二法：用于测定不易粉碎的固体药品第二法：用于测定不易粉碎的固体药品 第三法：用于测定凡士林及其类似物第三法：用于测定凡士林及其类似物比旋度：比旋度：不对称物质具有旋光性，当偏振光不对称物质具有旋光性，当偏振光透过透过1 dm，样品浓度为，样品浓度为1 g/ml的溶液，在一定的溶液，在一定波

6、长和温度下测得的旋光度称为比旋度。波长和温度下测得的旋光度称为比旋度。吸收系数：吸收系数：在给定的波长、溶剂和温度在给定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。液层厚度时的吸光度。反映了药物的紫外反映了药物的紫外吸收特征吸收特征20100a Dlc2、化学鉴别法、化学鉴别法（一）与强酸的呈色反应（母核）（一）与强酸的呈色反应（母核）甾体激素甾体激素类药物类药物呈色呈色H H2 2SOSO4 4 H H3 3POPO4 4 HClOHClO4 4 HClHCl与硫酸显色反应与硫酸显色反应 显显 色色 荧光荧光 加水稀释加水稀释泼尼

7、松龙泼尼松龙 深红深红 絮状絮状灰灰泼尼松泼尼松 橙橙 黄黄蓝绿蓝绿炔雌醚炔雌醚 橙红橙红 黄绿黄绿 红色红色 炔雌醇炔雌醇 橙红橙红 黄绿黄绿 絮状絮状玫红玫红醋酸可的松醋酸可的松 黄或微黄或微 褪色并澄褪色并澄 带橙带橙 清清( (二二) )官能团的反应官能团的反应肾上腺肾上腺皮质激皮质激素药物素药物呈色呈色四氮唑盐四氮唑盐OH1、C17 醇酮基醇酮基还原性还原性呈色反应呈色反应此外还有斐林试此外还有斐林试液、多伦试液液、多伦试液四氮唑比色法四氮唑比色法甾酮类甾酮类激素药激素药物物腙腙（黄色）（黄色）羰基试剂羰基试剂2.C2.C3 3酮基和酮基和C C2020酮基酮基常用的羰基试剂：常用的

8、羰基试剂：2,4-2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼具有甲酮具有甲酮基或活泼基或活泼亚甲基的亚甲基的甾体激素甾体激素类药物类药物蓝紫蓝紫色色亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠间二硝基酚间二硝基酚芳香醛芳香醛3.3.甲酮基甲酮基黄体酮黄体酮蓝紫色蓝紫色亚硝基铁亚硝基铁 氰化钠氰化钠其他甾体其他甾体淡橙色或淡橙色或不显色不显色有机氟有机氟F有机破坏有机破坏有机氯有机氯Cl4.4.有机卤素有机卤素茜素氟蓝茜素氟蓝 硝酸亚铈硝酸亚铈硝酸硝酸硝酸银硝酸银AgCl 呈蓝紫色呈蓝紫色 雌激素雌激素类药物类药物红色偶红色偶 氮染料氮染料重氮苯磺酸重氮苯磺酸5. 酚羟基酚羟基含炔基含炔基

9、的甾体的甾体激素激素银盐沉淀银盐沉淀硝酸银硝酸银6. 乙炔基的沉淀反应乙炔基的沉淀反应RCCHAgNO3RCCAg ( (三三) )制备衍生物测定制备衍生物测定m.p.苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙缩氨基脲衍生物缩氨基脲衍生物1. 缩氨基脲的生成缩氨基脲的生成m.p.约约182（分解）（分解）2. 酯的水解酯的水解丙酸睾酮丙酸睾酮碱性条件碱性条件睾酮睾酮m.p.为为150150 156-3-3-酮酮、苯环苯环、其他共轭结构、其他共轭结构（四）（四）UVUV法法1. 结构依据结构依据240nm240nm左右左右280nm左右左右结构特征：酚羟基结构特征：酚羟基、C C17 17 OHOH C C17 17

10、 乙炔基乙炔基炔雌醇炔雌醇OHCCHHO（五）（五）IRIR法法1505cm-1OH 3505cm-13300cm-1CH CC 1590cm-13610cm-1OH 酚羟基酚羟基醇羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨苯环的骨架振动架振动黄体酮黄体酮COHHHCH3O结构特征：结构特征：-3-3-酮、酮、C C1717- -酮基酮基1700cm-1 C=O20位酮基位酮基1665cm-13位酮基位酮基1615cm-1870cm-1 C-H双键双键（六）（六）TLCTLC法法 主要用于甾体激素类药物主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别制剂的鉴别 方法：对照品法方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点要

11、求供试品溶液所显主斑点的的颜色颜色和和位置位置与对照品溶液的主与对照品溶液的主斑点相同。斑点相同。（七七） HPLCHPLC法法 主要用于甾体激素类药物制主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）膏、醋酸氟轻松软膏） 方法：对照品法方法：对照品法 要求在含量测定项下记录要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的的色谱图中，供试品峰的t tR R与与对照品峰的对照品峰的t tR R一致。一致。返 回三、三、 特殊杂质检查特殊杂质检查（一）其他甾体的检查（一）其他甾体的检查检查方法（具有一定分离能力）检查方法（具有一定分离能力） TLCT

12、LC法（高低浓度对比法）法（高低浓度对比法） HPLCHPLC法（类似高低浓度对比法）法（类似高低浓度对比法）（1 1）TLCTLC法（高低浓度对比法）法（高低浓度对比法） 判定方法：判定方法：v 规定杂质斑点数目规定杂质斑点数目v 规定杂质斑点颜色规定杂质斑点颜色例：氢化可的松中其他甾体的检查例：氢化可的松中其他甾体的检查供试液：供试液：本品本品+ +氯仿氯仿- -甲醇（甲醇（9 9：1 1） 浓度：浓度：3.0mg/ml3.0mg/ml对照液：对照液：供试液（供试液（3.0mg/ml3.0mg/ml）+ +氯仿氯仿- -甲醇（甲醇（9 9：1 1） 60g/ml 60g/ml 层析：层析：

13、供试液供试液 点样、展开、斑点检出。点样、展开、斑点检出。 对照液对照液判断：判断：供试液如显杂质斑点，不得多于供试液如显杂质斑点，不得多于3 3个，其颜个，其颜 色与对照液的主斑点比较，不得更深。色与对照液的主斑点比较，不得更深。（2 2）HPLCHPLC法（主成分自身对照法）法（主成分自身对照法） 判定方法：判定方法：v 规定杂质峰数目规定杂质峰数目v规定杂质峰面积规定杂质峰面积硒的检查硒的检查（二）（二）来源来源 合成中用二氧化硒合成中用二氧化硒(SeO(SeO2 2) )脱氢脱氢有毒有毒方法方法药物药物氧瓶燃烧氧瓶燃烧二氨基萘比色法测定二氨基萘比色法测定0.0050.01Se的检查n原

14、理有机药物 氧瓶燃烧 SeO3 硝酸吸收 H2SeO4羟胺还原 Se4+ 二氨基萘试剂，pH2 4，5苯并苯硒二唑n378 nm 测吸光度n注：1.硒标准溶液的配制2.溶液的酸碱度3.有机酸的安全破坏（三）有机溶剂残留量的检查（三）有机溶剂残留量的检查甲醇甲醇 0.30.3丙酮丙酮 5.0%5.0% 内标法内标法 + + 校正因子校正因子以地塞米松磷酸钠为例以地塞米松磷酸钠为例 GCGC法法（四）游离磷酸盐的检查（四）游离磷酸盐的检查地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠对照品比色法对照品比色法（一）（一）HPLCHPLC法法USPUSP、BPBP、JPJP均采用均采用RPRPHPLCHPLC（大多内标

15、法）（大多内标法）（甾体激素类药物常含有结构相似的其（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）色法有干扰）四、含量测定四、含量测定（二二）UV法法-3-酮酮 240nm（）肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素孕激素苯环苯环 280nm（）雌激素雌激素肾上腺皮质激素、肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同雄性激素和蛋白同化激素、孕激素化激素、孕激素C3酮基酮基（1） 原理原理异烟腙（黄）异烟腙（黄）酮基酮基异烟肼异烟肼 3 3CHCl（缩合）（缩合）1. 异烟肼比色法异烟肼比色法（三）比

16、色法（三）比色法420 nmCONHNOHN异烟腙（黄色）异烟腙（黄色）（2 2）讨论）讨论反应速度（反应专属性）反应速度（反应专属性）A.C3=OC17= O 、C20= O C11= O 不反应不反应反应专属性反应专属性 C C3 3酮基酮基B. 溶剂的选择溶剂的选择异烟肼盐酸盐异烟肼盐酸盐受溶解度的影响受溶解度的影响无水甲醇无水甲醇无水乙醇无水乙醇对试剂的稳定性对试剂的稳定性好、呈色强度较好、呈色强度较无水乙醇中高、无水乙醇中高、但对植物油的溶但对植物油的溶解度小解度小C.C.水分、温度、水分、温度、O O2 2与光线的影响与光线的影响 含水量含水量腙水解腙水解A%O O2 2与光线对反

17、应的影响不大与光线对反应的影响不大t D. 酸的种类和浓度及异烟肼的浓度酸的种类和浓度及异烟肼的浓度酸：异烟肼酸：异烟肼=2：1 肾上腺皮质激素类肾上腺皮质激素类C C1717-醇酮基醇酮基强还原性强还原性（1 1）原理）原理2. 四氮唑比色法四氮唑比色法有色甲瓒有色甲瓒四氮唑盐四氮唑盐醇酮基醇酮基 a a 1717COH - 还原还原 CNNNNH三苯甲瓒三苯甲瓒深红深红CNNNN+Cl-氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑（TTC）红四氮唑（红四氮唑（RT）nmmax490480 e2 HCl-+CNNNNOCH3+-ClCNNNNOCH3蓝四氮唑（蓝四氮唑（BT）525 nm（2 2）讨论）讨论

18、A. 基团对反应速度的影响基团对反应速度的影响C11= O C11OHC21OH C21-酯酯B. 溶剂、水分的影响溶剂、水分的影响 以无醛乙醇为溶剂，水含量大时，呈以无醛乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过色减慢，不超过5对结果没有影响对结果没有影响C. OC. O2 2与光线的影响与光线的影响避光避光隔绝空气、快速、充隔绝空气、快速、充N N2 2D. D. 碱的种类及加入顺序碱的种类及加入顺序以以氢氧化四甲基铵氢氧化四甲基铵的结果最佳的结果最佳加入顺序：加入顺序：碱试液碱试液四氮唑盐四氮唑盐皮质激素溶液皮质激素溶液E. E. 温度与时间温度与时间室温（室温（2525）反应）反应404

19、045 min45 min（1 1）原理）原理max=465max=515雌激素雌激素3. Kober反应比色法反应比色法桃红桃红黄色黄色雌激素雌激素2 2OH乙醇乙醇 4 42 2SOHOHCH3O雌二醇雌二醇-3-甲醚甲醚CH3CH3OCH3CH3Omax=465max=5154 42 2SOH4 42 2SOHOH2 2铁酚试剂铁酚试剂(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚苯酚* 铁盐的作用铁盐的作用 加快黄色产物的形成、转化加快黄色产物的形成、转化 加强红色产物的稳定性加强红色产物的稳定性* 酚的作用酚的作用 加快红色产物的形成加快红色产物的形成 消除反应产生的荧光消除反应产生的荧光Iron-phenol Reagent返 回五、生物样本中甾体激素的分析五、生物样本中甾体激素的分析GC-MS:尿样尿样SPE萃取萃取衍生化衍生化GC/MS分析分析HPLC-MS:血清血清 HPLC/MS分析分析练习与思考练习与思考AA型题型题 1. 1. 醋酸地塞米松的鉴别方法是醋酸地塞米松的鉴别方法是A.A.三氯化铁反应三氯化铁反应 B. B. 水解反应水解反应 C. C. 柯柏反应柯柏反应 D.D.与碱性酒石酸铜试液反应与碱性酒石酸铜试液反应 E. E. 双缩脲反应双缩脲反应2. 2. 丙酸睾酮丙酸