2010省科技脑血管标书 222

1、摘要缺血性脑卒中是威胁人类健康的主要疾病，是人口死亡的主要原因之一，目前已经公认该疾病同时受遗传和获得因素的影响，而对获得因素的控制可以延缓或逆转疾病的发生和发展。缺血性脑卒中的发生涉及动脉粥样硬化和血栓形成，而与此相关的三个基因位点亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和血栓调节蛋白（TM）的表达水平与这两个过程密切相关，这些基因的突变已被证实与缺血性脑卒中相关。DNA 甲基化修饰是一种使DNA 发生化学修饰、无基因序列改变、但可遗传、可逆的表观遗传修饰方式，是表观遗传学的重要研究内容之一，表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果。过去研究发现基因

2、启动子区甲基化修饰的改变会影响到基因的表达水平，从而导致疾病发生，然而缺血性脑卒中相关基因启动子区甲基化修饰状况改变是否与缺血性脑卒中形成的相关，目前未见报道。故本研究拟采用病例对照研究的方法，利用基因测序技术、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技术对这三个基因启动子区的甲基化修饰状况与缺血性脑卒中的关系进行研究。研究成果将有助于缺血性脑卒中的早期干预，及寻找新的治疗靶点，为深入研究缺血性脑卒中的发病机制、临床诊断提供新的视角。四、主要研究开发内容和要达到的主要技术、经济指标以及将提供的研究开发成果及形式1、主要研究开发内容：1缺血性脑卒中患者特定基因甲基化修饰

3、状况的检测：以病例对照研究的方法，使用基因测序方法、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技术，并与同步检测的高血压组和正常对照组比较，测定启动子区的甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。2分析三种基因的表达水平，分析动脉粥样硬化相关基因亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和凝血相关基因血栓调节蛋白（TM）启动子区的甲基化修饰程度与缺血性脑卒中的相关性。3综合启动子区甲基化水平与基因表达水平及患者的临床表现，开发出一套较为完善的分子诊断方法。2、要达到的主要技术、经济指标：1.完成动脉粥样硬化相关基因亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHF

4、R）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和凝血相关基因血栓调节蛋白（TM）启动子区的甲基化修饰程度与缺血性脑卒中的关系研究，通过该研究获得缺血性脑卒中分子诊断的新位点和治疗的新靶点，以便使更多患者获得早期诊断和有效救治，而且能填补我国这方面的研究空白。2.使用基因测序方法、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技术测定该研究基因启动子区甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。3.对缺血性脑卒中的早期诊断和治疗将有助于减少我国缺血性脑卒中的致死率和致残率，减少国家和个人的医疗费用。3、将提供的研究开发成果及形式：1预期可获得我国缺血性脑卒中相关基因甲基化修饰状况，以及

5、缺血性脑卒中与MTHFR、LDLR和TM基因DNA 甲基化修饰的关系，并为缺血性脑卒中的基因诊断和治疗提供新方向。2使用基因测序方法、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技术测定启动子区的甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。3成果以论文形式在国家核心刊物上发表25 篇。一、立项依据(一)目的和意义本研究从表观遗传学角度，拟采用病例对照研究的方法，利用基因测序技术、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技术，对缺血性脑卒中与动脉粥样硬化和血栓形成这两个病理过程中所涉及的三个相关基因：亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、低密度脂蛋

6、白受体（LDLR）和血栓调节蛋白（TM）进行研究，观察其编码基因启动子区DNA 甲基化的修饰状况，并探讨其与缺血性脑卒中的相关性，成果将有助于缺血性脑卒中的早期干预，及寻找新的治疗靶点，本项目将为深入研究缺血性脑卒中的发病机制、临床诊断打下基础。(二)国内外概况目前脑血管病已成为我国城市和农村人口的第一位致残和死亡原因，且发病有逐年增加的趋势，我国每年有150万200万新发脑卒中病例，其中缺血性脑卒中占全部脑卒中的60%80%，随着人口老年化和经济水平的快速发展及生活方式的变化，缺血性脑卒中发病率明显上升，提示以动脉粥样硬化为基础的缺血性脑血管病（包括短暂性脑缺血发作，TIA）发病率正在增长。

7、全国脑卒中患者直接医疗费用支出年年递增，与医疗支出日益增长相对应的是脑卒中发病率不但未降，反而以每年10%的速度递增1。因此，早期诊断和治疗将有助于减少我国缺血性脑卒中的致死率和致残率，减少国家和个人的医疗费用。缺血性脑血管病是以动脉粥样硬化为基础的，目前，研究发现导致动脉粥样硬化的原因很多，其中高半胱氨酸（Hcy）血症是导致动脉粥样硬化(AS) 的危险诱发因素，并增加了脑卒中发生的风险1、2。其致As的机制包括损伤血管内皮细胞、促进平滑肌细胞增殖、导致氧化应激、激活炎症过程等2。同时血中高半胱氨酸水平还会引起血液的高凝状态和增加血小板的聚集性3，参与血栓的发生4。 Hcy是在肝脏、肌肉及其它

8、一些组织中由蛋氨酸(methionine,Met)脱甲基生成的一种含巯基的氨基酸。在体内，Hcy通过蛋氨酸合酶催化的甲基化反应可以转化成Met，这种酶促反应需甲基四氢叶酸为甲基的供体，后者由亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)催化产生，MTHFR是蛋氨酸代谢中的一个关键酶，该酶活性受其辅酶叶酸、维生素B12的影响。当MTHFR活性减低或表达下降时，出现高半胱氨酸血症5。MTHFR基因错义突变也可引起MTHFR缺陷，如热不稳定性及活性降低，其中677位C/T碱基突变最常见。人MTHFR基因定位于染色体1P363上，MTHFR6

9、77C-T突变导致原第222位密码子所编码的丙氨酸由缬氨酸替代，该突变位于亚甲基四氢叶酸还原酶N末端的催化区域，突变造成MTHFR热不稳定，使MTHFR活性下降，从而导致同型半胱氨酸(Hcy)增高6、7。国内外研究发现：MTHFR基因变异会是导致高同型半胱氨酸血症，引发动脉粥样硬化性疾病，使缺血性脑血管病的患病机率升高8-11。MTHFR的表达水平下降必将也导致血浆中同型半胱氨酸水平的升高，从而引发缺血性脑血管病。MTHFR表达的下调会受到多方面的调控，包括遗传和后天获得性因素，其中基因启动子区的CpG岛的甲基化可能是下调或关闭基因转录的最重要的调控方式之一。已经明确LDL异常在AS发生中占有

10、举足轻重的地位，而且胆固醇水平与缺血性脑卒中的关系很大，有关LDLR基因突变的研究报道已经证实并显示其与家族性高胆固醇血症、AS之间明确的因果关系，同时近期研究发现AS病人基因启动子区甲基化程度增高, 提示在LDLR基因调控区的高甲基化修饰可能参与了AS的发病12。但有关LDLR基因启动子区的甲基化修饰在缺血性脑卒中病人是否出现异常、及其与缺血性脑卒中的关系研究却迄今未见报道。缺血性脑卒中是在动脉粥样硬化基础上，当不稳定斑块破裂，伴随凝血/纤溶系统的失衡，表现为凝血功能的升高，纤溶功能的下降，局部血栓形成。血栓调节蛋白（thrombomodulin,TM）是近年来新发现的存在于血管内皮细胞表面

11、的糖蛋白，作为凝血酶的受体，它参与蛋白C（PC）活化，在调控血栓形成及溶解中发挥重要作用，此外，它还能降解纤溶酶原激活物抑制剂，促进纤溶，越来越多的研究表明，动脉粥样斑块的发生、形成及消退等与血栓、凝血系统密切相关，TM通过结合凝血酶，可以对抗由其损伤内皮引起的促动脉粥样硬化（AS）作用，因此，作为内皮细胞的保护因子之一，且具有抗血栓形成功能的TM在AS中的作用令人关注。TM水平表达变化被发现与脑梗死发生有密切关系。研究发现急性脑梗死的病人血浆TM浓度与脑梗死的严重度呈负相关，1月后的恢复期血浆TM 浓度较急性期显著升高13。而老年人腔隙性脑梗死和缺血性白质疏松血浆TM显著增高血清中TM 的浓

12、度检测有助病人的早期诊断和病情动态观察14。国内一些研究也表明与凝血功能有关的血清标记物的升高增加了脑血管疾病发病危险, TM与高血压一样是脑血管疾病独立危险因素15。近年来TM 基因多个位点的变异与脑血管病的关系也有较多的报道。有研究发现TM分子中Ala 25Thr的突变与血栓性疾病和心脑血管疾病有关, 是动静脉血栓危险因素16。然而，也有研究显示Ala 25Thr位点变异并非脑血管病主要危险因素17。另有研究发现C1418T 等位基因变异是卒中的潜在危险，虽然C1418T等位基因变异在亚洲人群较为普遍, 但前者与亚洲人群中脑血管病及血栓形成之间的关系目前还不明确18。其他研究发现与脑血管病

13、有关的变异包括：G21748C 位点突变导致SP-1反应元件与结合部位不相一致, 致使TM的转录发生改变；G21166A 突变改变了SSRE 的核心结合序列而导致内皮细胞功能异常, 从而增加血栓形成风险。但最近有研究报道TM 的G1748C、1208-1209 delTT、C1418T 这三种常见的基因变异与脑梗死的发病率、卒中后5年的总死亡率及血浆中TM 浓度的关系均无相关19。由此可见,目前对TM的基因变异与脑血管病的确切关系国内外尚无统一的结论。近来研究发现，TM表达的上调同样会受到多方面的调控，其中基因启动子区的CpG岛的去甲基化可能是TM基因转录的最重要的调控方式之一20。大部分情况

14、下，人类疾病有半数原因与基因遗传有关，另一半则取决于基因组外遗传变化，这种基因组外遗传变化是在不改变遗传信息DNA 序列的情况下，但基因表达却发生了可遗传的变化，这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其它可遗传物质发生改变，并最终导致了表型的变化，被称为表观遗传学(epigenetics)，从根本上讲，表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果。这种遗传方式的改变主要通过DNA甲基化和组蛋白的修饰来调控基因表达，其中DNA甲基化修饰是最早发现的、最常见的DNA修饰方式之一。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA

15、的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达21。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态；去甲基化状态和高度甲基化状态。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留22。甲基化可抑制基因的表达，而去甲基化则可表现出基

16、因的活跃。正常情况下CpG岛通常是以非甲基化形式存在于基因的启动子内，但在某些病理条件下或外界因素影响下，基因启动子的去甲基化会使基因转录增加。如王丽珍等23研究发现，高Hcy可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化，提高MTHFR mRNA 的表达水平。虽然对 DNA 甲基化的研究主要集中在肿瘤方面，但近年来表观遗传学，尤其是DNA 甲基化修饰在心脑血管疾病（尤其是动脉硬化）中的重要作用逐渐被重视。有研究发现动脉粥样硬化形成过程会出现异常的DNA 甲基化修饰，可能与动脉粥样硬化的形成的主要原因24。那么在动脉粥样硬化最终演变为缺血性脑卒中的过程中，是否存在异常的DNA 甲基化修饰情

17、况，而DNA 甲基化修饰情况是否与缺血性脑卒中相关，目前国内外尚未见文献报道。本项目拟通过病例对照研究，以缺血性脑卒中患者为研究对象，采用近年来被证明有效且各有优缺点的三种DNA 甲基化检测方法：甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA 方法）、基因直接测序方法25和SIRPH 分析技术26，并与同步检测的高血压和正常对照组比较，拟探讨动脉粥样硬化相关基因亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和凝血相关基因血栓调节蛋白（TM）启动子区的甲基化修饰状况与缺血性脑卒中的关系，从分子遗传学水平揭示缺血性脑卒中发病的分子机制，为缺血性脑卒中的分子临床诊断和寻求新的治疗靶点提供

18、理论依据。参考文献：1.中华医学会神经病学分会脑血管病学组缺血性脑卒中二级预防指南撰写组，中国缺血性脑卒中和短暂性脑血性发作二级预防指南2010，中华神经科杂志，2010，2（43）：1-7.2.Taylor LM J . Elevated plasma homocysteine as risk factor for peripheral arterial disease what is t he evidence ? Semin Vasc Surg, 2003, 16:215-222.3.Albaidi MK, Philippou H, Stubbs PJ , et al. Relation

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29、四氢叶酸还原酶基因启动子甲基化修饰及mRNA 表达的影响.卫生研究, 2007,3 :291-294.24.DeRuiter MC, Alkemade FE,et al. Gittenberger-de Groot AC, Maternal transmission of risk for atherosclerosis. Curr Opin Lipidol.2008,9:333-7.25.顾婷婷,张忠明,郑鹏生,等. DNA甲基化研究方法的回顾与评价. 中国妇幼健康研究.2006,6:1-25.26. EI-Maarri O, Herbiniaux U,Walter J,et al. A r

30、apid,quantitative,non-radioactive bisulfate-SnuPE-IPRP HPLC assay for methylation analysis at specific CPG sites.Nucleic Aacids Res .2002,30:e25.（三）市场预测和发展趋势缺血性脑卒中是威胁人类健康的主要疾病，是人口死亡的主要原因之一，我国发病率正逐年增加，并有年轻化的趋向。该研究有助于缺血性脑卒中的早期诊断和预防，以及为寻找新的药物靶点和特定基因的个体化治疗提供理论依据。二、研究开发内容、方法、技术路线（一）具体研究开发内容和要重点解决的技术关键问题1

31、具体研究开发的内容1.1 缺血性脑卒中患者特定基因甲基化修饰状况的检测：以病例对照研究的方法，使用基因测序方法、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA方法）和SIRPH分析技术，并与同步检测的正常对照组比较，测定启动子区的甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。1.2 检测三种基因的表达水平，分析相关基因启动子区的甲基化修饰程度与缺血性脑卒中的相关性。1.3 综合分析启动子区甲基化水平与基因表达水平及患者的临床表现之间的相互关系，开发出一套较为完善的分子诊断方法。2要重点解决的技术关键问题2.1 采用三种优势互补的检测方法，减少假阳性，提高实验的精确度。2.2 尽可能扩大样本数，提高研

32、究结果的稳定性和可靠性。（二）项目的特色和创新之处首次从表观遗传的角度研究与缺血性脑卒中相关基因的甲基化修饰状况，为进一步完善缺血性脑卒中的病因提供科学依据，为缺血性脑卒中的分子诊断、早期预防和治疗开辟了一个重要的新领域。（三）要达到的技术、经济指标及社会、经济效益1.完成动脉粥样硬化相关基因亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和凝血相关基因血栓调节蛋白（TM）启动子区的甲基化修饰程度与缺血性脑卒中的关系研究，通过该研究获得缺血性脑卒中分子诊断的新位点和治疗的新靶点，以便使更多患者获得有效救治，而且能填补我国这方面的研究空白。2.比较基因测序方法、甲基化敏感单链构象

33、分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH分析技术测定该研究基因启动子区甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。3.对缺血性脑卒中的早期诊断和治疗将有助于减少我国缺血性脑卒中的致死率和致残率，减少国家和个人的医疗费用，具有一定的社会和经济效益。（四）采用的方法、技术路线以及工艺流程1研究方法1.1 入选标准：按照中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010缺血性脑卒中诊断标准入选缺血性脑卒中患者100例和相匹配的高血压组及正常对照各100例。1.2 观察指标： 记录患者一般情况：年龄、性别、体重指数、肝肾功能、心血管疾病史、家族史、服药史、心血管危险因素等； 颈动脉超声：评价颈动脉斑块情况； 取

34、静脉血测量血半胱氨酸、血脂和TM水平； 取静脉血5ml 测基因DNA 甲基化。1.3 特异位点的甲基化分析： DNA 的提取； DNA 的亚硫酸氮钠修饰、纯化和回收； 甲基化敏感性单链构象分析（ methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）22又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP （ Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP），方法是：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG 二核苷酸区设计引物进行PCR 扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DN

35、A 电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA 的空间构象，而后者又由DNA 碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA 将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后行单链构象多态性分析加以明确（见图1）：图1：甲基化敏感性单链构象分析示意图这种方法的优点：A.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析；B.能够对甲基化的等位基因进行半定量；C.可以提示甲基化状态分布的不均匀性；D高通量的方法，价格便宜缺点是：A.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG 位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确

36、性略低；B.检测片段不宜过长。134 基因直接测序22基因直接测序：重亚硫酸盐使DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变（见图2），行PCR 扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR 产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG 位点发生甲基化。图 2：重亚硫酸盐处理过程示意图（直接测序）此方法的优点：可靠性及精确度高，能明确目的片段中每一个CpG 位点的甲基化状态。缺点：需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。 SIRPH 分析技术23SIRPH 分析技术是SNnPE 结合IP-RP-HPLC 对特定CPG 位点DNA 甲基化的定量测

37、定。是使用单核苷酸引物延伸（SNnPE）对特定CPG 位点进行DNA 甲基化定量分析方法：先将研究序列用硫酸氢钠处理，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。接着用侧翼有CPG 位点的寡核苷酸，通过重亚硫酸盐处理进行SNnPE 反应，根据各自位点的甲基化的还是未甲基化的，使用ddCTP或ddTTP 来延伸寡核苷酸，产物用HPLC 来进行分析。优点：反应是定量和线性的，可同时分析2-3 个位点，可对延长产物进行精确分析。缺点：实验步骤略复杂，若要检测多个位点时则需设计多个引物。1.4 采用荧光半定量PCR 方法测定血细胞中MTHFR、LDLR和TM mRNA 表达量。2技术路线确诊的缺血性脑卒中患者样本、高血压和正常对照样本各100例MTHFR、LDLR和TM基因mRNA表达MTHFR、LDLR和TM基因DNA甲基化测定血半胱氨酸、血脂和TM水平记录患者一般情况和颈动脉超声 直接测序MS-SSCASIRPH分析研究缺血性脑卒中组、高血压组和正常对照组间临床情况、颈动脉斑块情况、血半胱氨酸、血脂和TM水平以及相关基因MTHFR、LDLR和TM DNA甲基化程