分子筛渗透层析仪(Size-Exclusion

1、三合一偵測器技術(RI&DV&LS)於膠體滲透層析儀的原理與巨分子分析 用前言分子篩滲透層析儀（Size-Exclusion Chromatography, SEC） 是最常用的一種測量高分子聚合物之分子量分佈的技術 , 但長久以來SEC不易校正的問題一直讓人困擾。傳統的校正法是利用一系列窄分子量分佈標準品（Narrow distribution polymer standard）或一個已知的寬分子量分佈標準品（Broad distribution polymer standard）, 問題是只有幾種可靠的聚合物標準品(Polymer Standard)可使用。而一種聚合物標準

2、品所作成的檢量線，並不適用於另一種系列的聚合物，所以用SEC所測得的分子量僅適合用來在同種類聚合物間做相對比較。這種限制使得SEC的功能無法充分發揮。事實上在某些情況下，不同種類的聚合物間也有必要比較分子量，來釐清結構和分子量對聚合物性質上之影響。一種解決的方法是利用低角度光散射儀（Low-Angle Laser Light Scattering, LALLS)偵測器，它能偵測樣品中溶質（聚合物），產生一個與分子量大小成正比之訊號，且不需要標準品校正。但是在某一些聚合物-溶劑系統中，溶液折射率與濃度變化比值(refractive index increment, dn/dc) 和二階維里係數

3、(2nd Virial Coefficient, A2)必須知道。泛用分子量校正法（Universal Calibration, UC），長久以來被認為是解決SEC缺點的理想方法。此方法架構在水力體積(Hydrodynamic volume)M可由SEC的結構中測出。M對滯留體積(retention volume) 做出來的圖譜會隨分離管柱組合的不同而不適用，但不會因聚合物結構不同而不適用。此方法已有許多人證明適用在許多不同的溶劑系統。也有一些無法適用在UC法的例子，但其大部分都歸咎於本身結構無法有效分離的影響，事實上，滯留體積與M是否成絕對關聯性，已成聚合物對為SEC適用性的一個指標。很顯然

4、的，使UC法可行的最重要因素是黏度測定儀。而現今很多地方沒有使用此一技術的原因是之前沒有可靠的黏度測定儀被商業化。事實上 , 一些廠家曾利用毛細管原理，測出一支毛細管兩端壓差後，即可算出通過毛細管之樣品的極限黏度(Intrinsic Viscosity)。這些嘗試證明了利用毛細管法測定黏度的可行性，但也都因為靈敏度太低及基線（Baseline）不穩定的問題無法商業化。造成不靈敏及不穩定的原因很簡單，溶劑通過毛細管時所造成的基線壓力(Baseline Pressure）只比峰值壓力（Peak Pressure）低一點而已，很顯然的另一種能夠有效去除基線壓力的測量方法（例如微差測量法）是必需的。V

5、iscotek的微差黏度計(Differential Viscometer, DV)提供了一種測量溶液中比黏度（Specific Viscosity）的有效方法。將其DV中的毛細管系統做些許的改變，即可將其用在SEC系統中測量黏度。此微差粘度(DV)對溶劑壓力沒有限制，它可產生與比黏度成正比的訊號，這與RI中對濃度差產生訊號的原理類似，有了DV與RI我們可以找到sp/C。此裝置真正將泛用分子量校正法實用化了。利用泛用分子量校正法雖然是很好的主意，但與現代科技相較起來仍缺少了一些便利性。例如傳統SEC系統對幫浦流速與分離管柱（Column Set）的再現性要求頗高，否則泛用分子量檢量線無法真正適

6、用等，這些缺點雖然不是不能克服，但光散射儀操作上的便利性的確讓希望量測絕對分子量的研究者很難選擇。畢竟單角度的光散射儀因為待測樣品多樣性，無法測出令人滿意的結果 ; 而多角度的光散射儀角度外插的計算模式，存在著正確性疑惑。有鑑於此Viscotek公司發展出結合三種偵測器的系統，利用單角度光散射儀與微差黏度計和濃度偵測器，結合成一完整系統，完全排除了傳統SEC系統的缺點，。 前面所介紹的UC法測分子量是非常好的方法，它不僅可測絕對分子量，也可測分子的結構訊息，但它有一些缺點，也是傳統GPC的缺點，如分析管柱與校正曲線的適用性、部份非粒徑分離（Non-SEC）、幫浦流量之不穩定、儀品本身造成的擴散

7、效應（Band Broadening）等。此時光散射儀(light scattering)就顯出其優越性。光散射儀可直接測得絕對分子量，且省去一些傳統SEC的困擾，但若接在GPC上使用時，仍有一些缺點、困擾、與不足的地方，於是有人提出將其與微差黏度計與RI組合成一三種偵測器的系統，以彌其不足。將光散射儀連接到SEC上是非常有潛力的，過去20年裡，科學家們花費了很大的氣力發展它，希望在GPC上能得到絕對分子量分佈。早期的光散射儀的精度太低，尤其在GPC的操作上，樣品的濃度非常的低，通常在傳統方法的一個數量級以下，因此SEC上的光散射儀的訊噪比非常重要。 RALLS-Viscometer-RI系統

8、是取代傳統SEC，它不僅可以測得樣品的分子量及其分佈，也可以如前面所討論，測得一些分子形狀結構的訊息，使其在高分子、生化的研究應用領域很廣。因限於篇幅，無法在此一一深入討論個別應用實例，現舉幾個例子來說明其特性。應 用Dextran澱粉類的聚合物是挑戰性相當高的題目，不僅樣品準備困難，水相的流洗液對機器設備及分析管柱也是一大考驗，尤其Amylopectin分子量相當巨大，加上樣品彼此氫鍵力的干擾，使得分析管的分離效果常無法維持一致，因此更加凸顯使用光散射儀的優越性(圖21.22)。利用RI-DV-LS三合一多重偵測器，方便而輕易的測出正確分子量。Amylose和Amlopectin彼此間的含量

9、也可測出。M-H的圖形提供了線形Amylose和支鍵Amylopectin結構上的訊息。PolysaccharideChitosan是一種多醣類高分子，巨大無毒的聚合物。Chitosan可從chitin去乙醯化後萃取出。其應用相當廣泛,舉凡醫藥、化粧品、農業、環保、生醫材料等。如圖25.26。保健食品中多醣體的成份是很多研究者興趣的題目。這些保健食品如靈芝、冬蟲夏草或中草藥等，其中多醣體分子量及分佈，分子大小、含量等，在一般層析法中非常難以測得。現今利用Triple Detector System的技術，非常有效的解決上面的困境。Protein蛋白質的分離及純化，是一門很大的學問。蛋白質聚合物

10、常受到pH變化，氫鍵的大小以及濃度等因素，而有不同聚集(aggregate)現象。早期研究者以dynamic Light Scattering (DLS) 的技術來偵測蛋白質大小到最近利用MALDI-TOF-MS技術測量分子量及胺基酸排列。假如我們利用層析法來分離蛋白質，其後端串接上Viscotek三合一偵測器，同時可測得不同蛋白質Rh(Radius of hydrodynamic) 以及分子量。此外蛋白質分子構形在溶劑中表現hard sphere，在適當的溶劑下，蛋白質的構形可以unfold成一般的random coil的形狀。因此光散射偵器不因蛋白分子形狀改變，直接測得真正分子量。黏度計則會隨著分子構形的改變而有所增減。因此利用折射計，黏度計和光散射器結合三者各測得的訊息，可清楚獲知樣品分子大小及分子量。結論電腦科技的發達，使得層析技術又得以新生，在GPC/SEC的後段接上多元偵測器是必然的路，複雜的計算及數據處理可交由電腦處理，使用者