健中愈疡片对胃溃疡线粒体DNA修复酶调控机制的实验与临床研究

1、健中愈疡片对胃溃疡线粒体DNA修复酶调控机制的实验与临床研究         【摘要】  目的从分子水平探讨健脾益气方药在胃溃疡黏膜损伤修复过程中对线粒体DNA修复酶的调控机制及观察愈合质量，深入探讨线粒体DNA修复酶对胃溃疡的胃黏膜的修复逆转作用及中药的作用靶点。方法用临床观察和动物实验研究健脾益气方药对胃溃疡胃黏膜的保护与修复作用。比较健中愈疡片、黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃黏膜线粒体 8氧鸟嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶、3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的影响，并进行健

2、脾益气方药与黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃溃疡愈合质量的比较和评价。结果正常组线粒体DNA修复酶含量很低，胃溃疡组线粒体DNA修复酶含量很高，健中愈疡片组线粒体DNA修复酶含量较正常组极显着增高（P0.01），胃舒平组线粒体DNA修复酶含量与胃溃疡组没有差异(P0.05)，法莫替丁组线粒体DNA修复酶含量比胃溃疡组减少(P0.05)。而溃疡愈合质量则健中愈疡片组和法莫替丁组没有差异(P0.05),二者均好于胃舒平组(P0.05)；在脾虚证的改善上, 健中愈疡片组明显优于法莫替丁组和胃舒平组(P0.01)。结论 健中愈疡片对胃溃疡的治疗机理之一是对线粒体DNA修复酶进行了调控，提

3、高了修复因素，这是其作用靶点之一；而法莫替丁和胃舒平组治疗机理分别是减少损害因素和进行物理保护，其作用与线粒体DNA修复酶关系不甚密切；但对脾虚症状的改善上，健中愈疡片的作用远远高于西药组，显示了中医药治疗的优越性。 【关键词】  健中愈疡片 胃溃疡 线粒体DNA修复酶Abstract:ObjectiveClinical practice has proved that invigorating  spleen and benefiting vital energy Chinese  formulated products -Jian Zhong Yu Yang

4、Tablet(JZYYT) has  good curative effect on tough gastric ulcer. Our research is to reveal how the invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese drugs regulate the mitochondrion DNA repair enzymes, to reveal how Chinese drugs cure gastric ulcer, and to find the target of Chinese drugs.

5、MethodsOur study was to treat gastric ulcer by invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese drugs through clinical observation and experimental research, and compared with mucosa protectant -gastropine and H2 receptor antagonist -famotidine  about the mucosa mitochondrion 8-oxygen gu

6、anine DNA glycosylase, thymine glycol DNA glycosylase,3-methyl adenine DNA  glycosylase,  the effect of gastralgia, splenic asthenia and quality  of ulcer recovery.In clinical research, we observed  the rank of gastralgia, splenic asthenia and compositive therapeutic effects. In

7、animal experiment, we detected the body weight, frequency of twisting in unit time, suspending time, index number of gastric ulcer, and microcirculation of gastric mucosa such as the value of  B/(R+G+B) to clarify the regulation effect of invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese

8、drugs on mitochondrion DNA repair enzymes, and the therapeutic effect  on gastric ulcer in molecular level.ResultsMitochondrion DNA repair enzymes were the lowest in the gastric mucosa of normal group, but they were very high in gastric ulcer group, there had significant difference between them

9、（P0.01）；Mitochondrion DNA repair enzymes had no difference between gastropine group and gastric ulcer group（P0.05）；Mitochondrion DNA repair enzymes in  famotidine  group  decreased  extremely compared with gastric ulcer group（P0.01）,but still extremely higher than normal group（P0

10、.01）；Mitochondrion DNA repair enzymes were the highest in JianZhongYuYang Tablet group, and had extreme differences compared with each of the other 4 groups（P0.01）. Grade of gastralgia：before treatment ,there had extreme differences  between normal group and the other 4 groups（P0.01），there had

11、no differences among the other 4 groups（P0.05）.After treatment, grades of gastralgia in JianZhongYuYang Tablet group and famotidine  group were the lowest, and had no difference between them（P0.05）；the grade of gastralgia in gastropine group was lower, there had extreme difference compared with

12、 gastric ulcer group（P0.01），but also had extreme differences compared with JianZhongYuYang Tablet  group and famotidine  group. In the difference of grade of gastralgia before and after treatment, JianZhongYuYang Tablet group had no difference compared with famotidine  group（P0.05），bu

13、t gastropine group had obvious difference compared with JianZhongYuYang Tablet group（P0.05），and had extreme differences compared with famotidine  group（P0.01）. Syndrome of splenic asthenia：before treatment ,the rank of splenic asthenia in each group was balanced except normal group. After treat

14、ment, the change of splenic asthenia in JianZhongYuYang Tablet group was the biggest, and had  extremely significant differences from the other 4 groups（P0.01），famotidine  group and gastropine group was extremely significant differences compared with gastric ulcer group（P0.01），but famotidi

15、ne  group had no difference with gastropine group（P0.05）.ConclusionTo treat gastric ulcer, JianZhongYuYang Tablet has excellent effect to relieve pain and to eliminate splenic asthenia.It has the same effect with famotidine to alleviate pain, but is better than western drugs in eliminating sple

16、nic asthenia and improving microcirculation of gastric mucosa. In mechanism of action, JianZhongYuYang Tablet can increase the mitochondrion DNA repair enzymes greatly to repair the damaged gastric mucosa, and promote the self-cure of gastric ulcer, this is the difference to western medicine. Wester

17、n medicine emphasize the counteraction against harmful factors, while JianZhongYuYang Tablet focuses on self-repair, it is  consistent with the theory of traditional Chinese medicine "supporting healthy energy to eliminate evils", "if healthy energy is inside, evil factors can no

18、t come in". So our research give the evidence to show the superiority of Chinese drugs. We know, the function of Chinese traditional patent drugs have  multiplicate  mechanisms to cure disease, our study proved one of the targets of Chinese traditional patent drugs how to cure gastric

19、 ulcer only, that is : Chinese traditional patent drugs can adjust mitochondrion DNA repair enzymes.With the development of molecular biology, we wish we can find more mechanisms of Chinese traditional patent drugs trough experiments in the future, and make greater contributions to the cause of inve

20、stigating, developing the precious wealth-traditional Chinese medicine.Key words:JianZhongYuYang Tablet；  Gastric ulcer；  Mitochondrion DNA repair enzymes   刘友章教授是广州中医药大学第一附属医院大内科主任，博士后导师，他首次提出了“脾主运化与细胞线粒体具有相关性”的理论，胃溃疡是针对胃黏膜的侵袭因素超过防御因素和修复能力的结果1。笔者从临床观察和动物实验两方面研究了健脾益气方药对胃溃疡胃黏膜的保护与

21、修复作用。比较了健中愈疡片、黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃黏膜线粒体 8氧鸟嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶，3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的影响，并进行健脾益气方药与黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃溃疡愈合质量的比较和评价。现报道如下。1  临床观察部分1.1  方法病例收集在广州中医药大学第一附属医院病房、胃镜室及内科进行。选择10例胃镜下没有胃黏膜病变的健康人为健康人组，作为比照标准，其中男性5例，女性5例，最大年龄58岁，最小年龄22岁。选择40例脾气虚型胃溃疡患者（纳入标准均按照中药新药临床研究指导原则），其中男性22例，

22、女性18例，最大年龄62岁，最小年龄20岁，病程最长15年，最短3个月，随机分为胃溃疡组10例，健中愈疡片组10例、胃舒平组10例和法莫替丁组10例，各组除用药外，性别、年龄、病程等都均衡一致，没有显着差异。使用仪器为OLYMPUS CLV-u40电子胃镜，奥林巴斯公司生产。取材地址为广州中医药大学胃镜室。用药前1天晚上20时后禁食，第2天在胃镜下看准胃角，在大弯侧体窦交界上10 cm，小弯侧胃角上4 cm处各取组织2块，冷冻于70的液氮罐中备用。   胃舒平组：用胃舒平片1.4 g/次（0.35 g/片×4片），4次/d口服，餐前1 h及睡前服用，压碎或咀嚼服用

23、。   法莫替丁组：用法莫替丁胶囊，20 mg/次，2次/d，早晨及睡前口服。   实验药品：健中愈疡片由广州中医药大学第一附属医院制剂室制备，批准文号：粤药制字Z03020828，批号：050203，组成为党参、白术、黄芪、莪术、救必应、延胡索、蒲公英、白及、乌贼骨、珍珠末等，制成素片，每片250 mg(含生药7.45 g)。消炎痛（吲哚美辛）由广东华南药业有限公司生产，批准文号：国药准字H44020701，产品批号：060101。胃舒平（复方氢氧化铝片）由广东三才医药集团有限公司生产，批准文号：国药准字H44021288，产品批号：20060520。

24、法莫替丁由广州白云山侨光制药有限公司生产，批准文号：国药准字：H44020955，产品批号：60090。3组均在服药后30 d复诊，按前述方法取材，并用PCR方法测定各组胃黏膜组织中胃黏膜线粒体 8氧鸟嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶、3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的含量及进行疗效判定。   试剂盒均由着名生物工程公司如中山大学达安基因股份有限公司、广州市达辉生物技术有限公司提供，由中山大学达安基因股份有限公司及联合生物集团（中国）广州分公司生产，包括上游引物F(2管)，下游引物R（2管），Dntp,逆转录RT-buffer，逆转录酶（MMLV），Taq酶，dd

25、H2O，阳性标准品（20管），5×定量buffe，批号：20060418。实验地址为广州市达辉生物技术有限公司205实验室属于中山大学达安科技园，所使用的实验室为卫生部医药生物工程技术研究中心，为国家发展和改革委员会2005年颁发授予的国家高技术产业化示范工程。使用仪器为ABI PRISM 7000 SDS荧光定量PCR仪，ABI prism公司生产。   胃痛分级标准：见表1。表1  胃痛分级标准（略）   脾虚轻重程度分级：见表2。表2  脾虚轻重程度分级标准（了）    疗效判定标准

26、60;  临床痊愈   全部症状消失；   受试对象所患西医诊断的胃溃疡，有相应的客观诊断指标证实确有显着改善；   脾虚参考指标治疗后有明显改善。   具备项即可判断，项作参考。   显效   症状有明显改善，即改善在2级以上（如变化为）；或个别主症改变在1级，而其它主要症状全部消失；   受试对象所患疾病的客观诊断检查指标有所好转；   脾虚参考指标治疗后有所好转。   有效项为必备，项作参考。

27、0;  症状均有好转，改善在1级以上者，或个别主症有显着改善（如由变为）；   受试对象所患疾病的客观诊断检查指标稳定；   脾虚参考指标有相应好转。   无效   症状无改善；所患疾病的各项客观检查无变化；脾虚参考指标亦无变化。         2  动物实验部分2.1  脾虚模型的建立270日龄180220 g成熟Sprague Dawley大鼠雌雄各半随机分为5组(n=10)。按常规煎法制备小承气汤（

28、大黄厚朴枳实453），模型组：每日灌饲小承气汤煎剂 60 g/kg（20 ml/kg），隔日半量进食，自由饮水；正常对照组：常规饲养，共15 d。   实验动物质量合格证明：NO0016901,质量检测单位：广州中医药大学实验动物中心，检测日期：20060330。许可证号：SCXK(号)20030001号监证字：2006A014，20060712。实验室为广州中医药大学动物实验中心的SPF级实验室，为广东省科委批准的广东省实验动物技术培训中心，通过了“211工程”子项目的验收。所用单味中药均一次性购自广州中医药大学中药房。2.2  消炎痛皮下注射法胃溃疡造模3脾虚

29、造模15 d后，大鼠禁食不禁水24 h，取消炎痛先溶解在5%的碳酸氢钠溶液中，实验时用蒸镏水稀释成0.4%的浓度。以消炎痛20 mg/kg背部皮下注射消炎痛，造成胃溃疡模型。2.3  分组与给药A正常对照组：灌胃给予0.9%生理盐水2ml/只，18 mg/（kg·d）；B脾虚型溃疡模型组：灌胃给予生理盐水18 mg/（kg·d）；C健中愈疡片组：灌胃给予健中愈疡片5%混悬液2 ml/只，110 mg/（kg·d）；D胃舒平组：灌胃给予3.5%胃舒平2 ml/只，205 m g/（kg·d）；E法莫替丁组：灌胃给予0.06%法莫替丁2 ml/只，

30、1.46 mg/（kg·d）。各组药物灌胃前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制为混悬液使用。实验期间常规饲养，自由饮食,处死动物前禁食24 h，但饮水自由。2.4  用Okabe改良法进行胃黏膜损伤评分4将鼠胃固定于10%甲醛溶液中，20 min后沿胃大弯剪开冲洗，根据Okabe改良法测定出血病灶：先计算总溃疡（黏膜缺损）数，将溃疡最大径1 mm 者按大溃疡计，测量其长宽径，按（长径×宽径）/2×公式计算溃疡面积。最大径小于1mm 者以小溃疡计数，以两者计分总和综合评定溃疡指数，作为溃疡严重程度的指标。计分标准无病变计0分，小溃疡个数在15个计0.5分，个数

31、在620个或面积在15 mm2计1分，以后溃疡个数每增加20个和面积增加5 mm2计1分，进行胃黏膜损伤的定量化。2.5  大鼠体重、悬吊实验及扭动次数5大鼠在实验前，脾虚造模后，健中愈疡片、胃舒平、法莫替丁灌胃后均用电子天平秤体重及用秒表测量悬吊时间，做为脾虚症状加重和改善的指标。用半小时肢体扭动次数来做为胃溃疡疼痛程度的指标。2.6  大鼠胃黏膜微循环状态测定用中性红比色法，自尾静脉注入0.1%中性红（8 mg/kg），30 min后剪取胃黏膜，用三角架固定数码照相机，固定参数进行拍摄，然后并用Photoshop 7.0 软件的RGB比色功能将红色进行定量，然后对微循环

32、状态进行比较，间接反应出溃疡愈合的质量。2.7  数据处理所有数据均采用SPSS11.5 for windows统计分析软件处理，属于正态分布的计量资料以±s表示，采用单因素方差分析。计数资料及等级资料采用多个独立样本的非参数检验。2.8  结果见表313。表3  8氧鸟嘌呤DNA糖基化酶含量(略)表4  8氧鸟嘌呤DNA糖基化酶各组P值比较(略)表5  胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶含量(略)表6  胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶各组P值比较(略)表7  3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶含量(略)表8  3甲基腺

33、嘌呤DNA糖基化酶各组P值比较(略)   表38表明，正常组线粒体DNA修复酶系列的含量很低，而胃溃疡组自我修复所以含量很高，法莫替丁由于减少了损害因素，所以反馈性地降低了修复酶含量，胃舒平只是物理保护作用，对修复酶影响不大，健中愈疡片大大提高了修复酶含量，增加了自我修复因素。3  讨论   胃黏膜的损伤常由诸多有害因素引起6，诸如酸、碱、乙醇、胆盐、HP、急性失血、精神应激等，药物对胃黏膜的损害的作用也十分常见。胃溃疡的黏膜修复，是指胃黏膜对有害因素如对食物、幽门螺杆菌感染、乙醇、酸、胆盐、非固醇类抗炎药、应激及温度（过冷、过热）等造成黏膜损

34、伤的修复能力6。在Tarnawske 等第一次提出溃疡修复质量（Quality of ulcer healing，QUH）的概念后7，人们对溃疡修复的认识开始由研究外在修复因素转向侧重内在修复因素。溃疡修复的过程十分复杂，目前认为影响胃黏膜修复质量的因素主要有：胃黏膜微循环的血流量；生长因子的调控；花生四烯酸的代谢产物的影响；氧自由基对溃疡修复质量的影响；老龄化对溃疡修复质量的影响；HP对溃疡修复质量的影响；抗溃疡药物的影响。但胃黏膜线粒体DNA修复酶在胃溃疡修复过程中的机制以及中药对其的调控研究还是一片空白。表9  胃痛评分(略)表10  胃痛定量P值比较(略)表11&#

35、160; 脾虚症状变化例(略)表12  大鼠胃黏膜损伤评分、体重、悬吊时间及扭动次数(略)表13  大鼠胃黏膜微循环状态变化(略)   线粒体DNA修复系统相关酶的研究现状8：作为真核细胞能量中心的线粒体,拥有自己特异的遗传物质线粒体DNA(mtDNA) 。mtDNA编码的每一个亚单位都是线粒体完成正常的氧化磷酸化过程所必需的,因此,线粒体基因组的完整性对于生物体的损伤修复十分重要。长期以来,人们一直认为线粒体中不存在DNA 的修复9，10 。但近年来在线粒体提取物中却检测到了修复因子,其中大多数是参与清除DNA 中单个突变碱基的碱基切除修复途径(BER) 的酶,提示线粒体中存在DNA 修复。当前,对线粒体DNA 修复过程的理解是一个具有重要意义的课题,因为它将有助于探明线粒体DNA 的自我修复机制对溃疡愈合的意义。已