乙型脑炎核酸疫苗的研究进展.docx

1、栏目协办腾骏药业wSS国索高齿技术企业乙型脑炎核酸疫苗的研究进展王凤'.汤德元，曾智勇马摩.李春燕'.刘U2徐健'(1责州大学动物科学学院.贵州贵阳550025,2.贵州省动物疫病预防控制中心.贵州贵阳550008)摘要：乙型脑炎是一种严重威胁人畜健康的急性中枢神经系统传染病,也是重要的人帝共患的虫媒病毒病.被国际兽医局(OIE)列为B类传染病。该病对猪的致死率不高.但能引起怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎.公猪发生塞丸炎.育肥猪引起持续高热.仔猪常呈脑炎症状.直接影响猪群数量的扩大，对养猪业造成严重危害.也影响人类的健康。目前本病尚无特效疗法,主要依靠疫苗预防.世界卫

2、生组织己把研究和开发防治乙型脑炎疫苗列为优先研究和开发的项目之一.本文主要对乙型脑炎病毒核酸疫苗目前的研究现状进行了综述.为乙型脑炎核酸疫苗的深入研究提供参考。关键伺：乙型脑炎；核酸疫苗:研究进展:”06年黄州事商届次人才科条件村*麟日曾助(Mt,TZJF-200«+0l号)会册大乎JU,作会介，工尽dm-).*.义会从事功物停建病病廉分子生物手$Jt.it讯作耆,尚健九M.赦裁.命士生不希.1委从动物停豢病*位合赦学科研工作.E-aallItdyuan®I*3.co*乙型脑炎(Japaneseencephalitisvirus,JEV),足由乙型脑炎病嵌引起的传染性疾病。

3、诙病对养猪业造成严杭危害，尤其是近年来集约化养猪业发达的国家损失靖为严爪。虽然兽医科研人员和养猪业者进行多方面的努力，采取包括种源控制、疫病净化、消版隔离和早期断奶等防治措施，但仍不能禁绝核病的发生和蔓延.目前预防乙型脑炎病业感染的技苗有灭活疫苗和德版活疫苗.但由于灭活疫苗存在注射削虻大，需多次注射.效果不枪定、免疫力不持久及副作用大等不足之处,我国研制的SA14-14-2株诚寿活疫苗航然保护性好.叮以很好地刺激机体产生细胞免疫和体液免疫.但活疫苗毕竟是一种活的澈生物.有可能出现毒力反强、帝毒、排毒、弱直传播、核酸败组等现象，而旦通过常规的血清学方法一般与自然感染无法区分.因此，人们在设法利用

4、生物技术开发新型尊因工程疫苗即核酸疫苗以克服现有疫苗的缺点.是当前研究的热点.现将其进行如下综述。1乙型脑炎病毒的基因结构及其核酸疫苗候选基因的选择1.1乙型脑炎病毒的基因结构JEV为单股正链RNA病每.全长约llkb,整个基因组由5,褊非编码区(5,NCR)和1个几平跨越整个基因组的单一开放阅读框(ORF)和3'端非编码区(3'-NCR)构成。编码3个结构蛋白：C蛋白(衣壳蛋白)、PrM/M(膜前体金白/膜蛋白)和E贺白(世膜糟蛋白)以及7个非结构蛋白(NS1,NS2a,NS2b.NS3、NS4a.NS4b、NS5),各基因在基因组上的排列顺序为：5'-CPrM/ME

5、NSlNS2aNS2bNS3NS4aNS4bNS53'.1.2乙型脑炎病毒核酸疫苗候选基因的选择PrM蛋白姑未成熟病嵌体的一部分，在病嵌感染后期.它在被水解为M蛋白后而发育为成熟的病毒体。PrM蛋白存在感染细胞内未成熟的病柢粒F中，在JEV感染的最后阶段，水解成M蛋白.然而.在有些情况下.PrM的弈切叮能不完全,结果使PrM蛋白成为毒粒上能产生中和抗体的附加帕位,免疫含PrM/E的胞外颗粒可产生中和抗体和保护性免疫.表达PrM蛋白或E蛋白的更组痕苗病催免疫小鼠和猪.可有效保护JEV的攻击叫而且，JEV糟索门容易分泌和发达在细胞&而,这些是大作为有效免疫原的爪要决定因素。Mf|是

6、完全疏水的，签与病母黄膜的构成.是病毒索膜主要结构成分之一，被包埋在卖膜的脂质双层中，它可能与插入脂双层的E贺|*1完全疏水性C端相互作用，对维持E强白空间结构是必需的。Takegami等(1982)府共生物学功能进行r研究.认为M蛋白参与病毒的感染过程，PrM贺白足状/诱发保护性免疫的戒要:协同成分,M/白能白生具有轻度中和作用的抗体.E蛋白全长由500个找破酸度基组成,分子质虻约为53kD,富含Gly和Ala.Pro含量低，是破水性的.仅有一的糖基化位成在多数黄病嵌中JI有保守性.E蚩白含有病柩血萩泰和中和抗原决定箴，为黄病毒属中的主要结构蛋白，是主要抗原成分.在i秀导机体产生有效的中和抗

7、体及保护性免疫中起敢要:作用.此外，E蚩白还与细胞膜受体相结合并与细胞膜融合而使病茬进入细胞.与病盘的吸附、穿入、致病性、组织嗜性、血畿反应、血清特异性和i秀导宿主的免疫应答等作用紧密相关ElKfl上相关位点的敏基酸变异.对JEV神经母力及神经侵鉴力有杵政要的影响。另外.JEVE蛋白还是引起冶主机体免疫及产生中和抗体的左要:抗原蛋白，由它形成表面抗原决定族,具有血凝活性和中和活性,能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击.NS1蛋白是一种分泌型糟卷自.其分子质吠为40kD,但由于在130位和207位存任N述接糖链.在感染细胞内共:实际分子质械为46kD左右.Mason等(1989)用E.c

8、oli来表达JEV抗原.证实在JEV感染的细胞中NS1蛋白以NS1和NSr2种形式存在.NS1和NSr在N末端具有相同的序列，NS1'在C末端还存在一段高度磴水的氛基酸序列，该段序列由基因组的NS2aU因编码。NS】分子质址约40kI),NS1*为58kD.由于NS1和NSH存在相同的N末端.故有相同的抗原性和生化特性，Nsr是主要的病毒产物，而不是在NS1产生过程中短暂存在的.在细胞培养液中NS1的ht大，可能是因为NS1比Nsr更有效地分泌到细胞外城Nsr在释放过程中被降解为NSl.NS1蛋白特异性免疫探针与JEV感染细胞结合的结果说明，其分泌F感染细胞表面.另外，感染细胞还分泌可

9、溶性的NS】在NSl'C末端存在一段高度疏水的氛基酸序列，使NSI蛋白存在于细胞表面成为可能。Mason等在TritionX100存在的情况卜通过超速离心发现，NS1蛋白的沉降特征发生r改变，脱明NS1蛋白与膜相互作用结合在起.NS1在感染细胞的表面表达，细胞外分泌，不但在黄病毒的感染过程中可引起免疫性反应，而fl这种抗体在实验动物体内可起保护作用，这个保护作用依翰抗体的Fc部分，因为NS1季一性抗体通过补体依赖途径杀伤感染的祀细胞(功NS1蛋白不组成荏粒，没有中和活性和血凝抑制活性，但它JlYl4溶性补体结合活性，它可在不出现中和抗体的情况下诱生保护力,IL不产生抗体依赖性增强，加之

10、NS1的基因和表型具有高度同源性.有学者认为黄病胜NS1作为亚单位疫苗比灭活疫苗有优势叫2乙型脑炎病毒核酸疫苗研究进展2.1有关PrM、E基因核酸疫苗的研究AshokMS等151构建了编码JEVE蛋白的DNA质粒PCMXENV,经鼻腔和肌肉途径接种瑞士小鼠后，进行JEV脑内接种攻击试验.结果显示：该歌组质粒对攻击感染有一定的保护作用，免疫鼠血清中未能检出抗JEV抗体，但产生了低水平的JEV特异性T细胞增殖。后来Jt乂将E蛋白的全长庙因序列和钗基端398个钗基嵌的基因序列分别克隆到表达载体发现：只有后者能产生分泌性表达»而且与其他DNA疫苗比较.后者可诱导Thl和Th2的增殖反应，在小

11、鼠能产生最高水平(71%)的抗攻击保护.E基因全长DNA疫苗在小鼠体内只能诱导低水平的中和抗体，认为保护作用可能上要与细胞免疫有关凶。Konishi等(1998)以pcDNA3.1为我体构建了含JEV中山株前膜信号肽(S)、PrM、E基因cDNA的壅组成粒PCDNA3.1JEME,将此质粒IOOpg肌注小鼠，间隔2周再注lOOpg,2-3周之后采血溯定中和抗体，滴度为1:640.用P3株】01%腹腔攻击，100%(5/5)存活，若用10pg成粒，中和抗体为1:320,存活率100%,免疫持久性至少为6个月。Chang等构件了表达PrM和E蛋白的质粒DNA,由巨细胞病催正即早期基因启动子控制，将

12、该质粒导入COS1细胞，COS1细胞向培芥液中分泌细胞外病嵌样颗粒，用这种DNA疫苗免疫雌性小鼠，产生中和抗体滴度在1：20到1：160之间，用5000PEU强卷株SA14腹腔注射攻毒，对买子代的保护率在40%到100%之间.免疫7周龄的成年小队，3d后用5000PUF强曜株SA14攻毒，小鼠得到完全保护.Chang等的研究表明，所朽接种1次JEVDNA疫苗的小鼠体内可产生JEV特异性的抗体，R至少维持18个月,3周靛小鼠免疫后100%血清抗体阳转.中和抗体效价达】：201：160.狭得100%的动物保护.Chcn(1999)等利用M核发达栽体分别取组构建了JKVEJg白以及其他蛋白旌因片段，

13、通过比较上述收组质粒在分别免疫动物后所产生的中和抗体效价与保护性免疫效果.发现含JEVE蛋白编码基因的成粒DNA所致的中和抗体效价以及保护性免疫结果明显优共:他策白基因片段，用编码JEVE蛋白的质粒免疫小队.与灭活疫苗比较，结果产生了更持久和更强的JEVE蛋白特异性抗体，且对JEV的致死攻击R有高度保护作用.Konishi等四构建了2株基FPrM和E基因的DNA疫苗，并进行了免疫试驶.结果表明以100-450pgMtt间隔3周对猪进行二次免疫.免疫后第1周即产生HI抗体和中和抗体，井可维持245d的高滴度H1抗体水平.试验还证明当以PrM/E质粒DNA疫苗免疫小鼠后，取JI：脾细胞在体外刺激后

14、可检测出CTL活性,而血清中未能检测出中和抗体.但当小鼠接受JEV攻击后，由于DNA免疫小取存在泥忆性B细胞和T辅助细胞,中和抗体的滴度迅速上升，并足以保护小鼠抵抗JEV的攻击。他们认为这也许站免疫动物伏得保护的机制。Konishi等还发现含病版PrM与E蛋白编码基因的爪组质粒DNA在免疫动物后不仅i秀导出特耳性的CTL细胞参勺细胞免疫反应，而H可产生特异性B细胞参与体液免疫反应，进步研究还发现在免疫动物体内产生的中和抗体的效价与所维持时间都明显高于普通灭活疫苗的免疫结果，说明了DNA疫苗在预防JEV感染方面的试凝研究的可行性。据报道.基因枪免疫所需的DNA魅仅为肌注免疫所需址的1/1001/

15、200,就可获得相近的抗体反应.Chen等的研究结果不但证实这一结论，而ILi人为不同的DNA免疫途径产生的抗体亚型和亲和力也不同.KaurR等回用合成分泌型或膜锚定型JEV的PrM和E蛋白的质粒经肌注或堆因枪接种小队发现:E蛋白的2种发达类型均能诱导较高的中和抗体滴度，而肌注较基因枪方法能i秀导更高水平的抗E抗体反应.认为肌注可能诱导以Thl为主的免疫反应，而基因枪接韩诱导Th2为主的免疫反应，在小耻而JEV脑内接种的攻击感染可提供60%的保护.Mohammad"0'等以小鼠作为模型，用抗原提呈细胞和巨细胞病也对JEVE炭自的麦达进行免疫调并采用免疫荧光法和Western印

16、迹检测，结果抗原提呈细胞和巨细胞病能都能刺激小队产生的抗体滴度增加，但是巨细胞病春刺激小鼠产生的抗体滴度更高。更谊要的是.由原提呈细胞启动执导的免疫反应偏向Thl型.prM幕因和E基因，分别在N15和N154的位置有一个潜在的N-械幕化位点，YuZhang等分别在prM基因和E基因的N-连接摘基化位点进行突变处理来构建DNA疫苗.该DNA疫苗免疫小鼠.的结果表明，E笔因N154精基化位点突变的DNA疫苗能使小鼠分泌1L4的水乎升高和产生更大滴度IgG.获得完全保护.因此，EUfflN154概基化位点突变能增强诱导体液免疫应答，表明这种突变可作为针对乙脑潜在的DNA疫苗。2.2有关NS1基因核酸

17、疫苗的研究Lin等用编码JEVPrM/E.NS1辑因的成粒DNA皮下接种小鼠，结果发现.编码PrM/E蛋白的成粒DNA免疫小取攻击强毒后有70%的小鼠受保护.而用编码NS1的质粒免疫小虬强卷攻击后可获得90%的保护。NS1质粒免疫的小队虽未检测到中和抗体,但对乙粘病毒感染的细胞在补体参与条件卜有很强的溶解细胞作用。用C末遂幻H60个氛基酸的NS1核小酸序列(NS!*)的质粒免疫小取却经不住强卷的攻击.生化分析&明，NS1很容易分泌大St的同烈二聚体并表达于细胞发面，NSP却不能，且NS2a会F调NS1基因疫苗的效果。不管站用抗NS1单抗被动免疫，或者是用NS1蛋自主动免疫，均证明黄病柩

18、NS1具有激发保护性免疫的友位，证实NS1足够引发保护性免疫。然而.辛期件名学者以痕苗病毒、Sindbis病毒和杆状病毒等R组病毒为载体的研究表明，JEV的NS1只能对宿主产生低水平的保护作用.这种差异可能由于使用不同的表达系统和不同的NS1序列.也有可能是在病是我体的存在下，NS1只能作为很弱的免疫原或多余的NS2A的些序列可能是导致NS1不能产生右效免疫保护的原因.这些结果与以往对雅华热的研究结果相符，取组痘苗病魅含甘革热NS1可完全保护登革热病催的攻击但在NS1加t15%的NS2a序列后，就不能获得相似结果：.使用核酸疫苗进行免疫既能消除在活疫苗制备中存在的不必要抗原所致的免疫应答，又不

19、必顾虐感染因子所带来的诸多问禽.而且.能晒诱导广泛的体液与细胞免疫应答.有助于产生高水平保护性免疫叩。但核酸疫苗效力的好坏也取决F许多因素，如抗原自芽的特性、免疫途径、是否使用佐剂或使用佐制的矣型等.所以现在人们对影响核酸疫苗效力的各种因素展开r研究心.如果核酸疫苗潜在的安全性和接种方法能够得到解决和改进，将具有很大的开发潜力和应用前景。参考文献II)汤嬉元.王机.马萍.等.乙型脑炎病毒岚州分高株E某因原核发达及其免疫原性的研究J1.俗牧件医学报，2012.43(8):13301336.(21TangDY.LiuJ,WangF,etal.Isolationandmolecularcharact

20、erizationofJapaneseencephalitisvirusGZstrainfrompiglets,China|J|.AfricanJournalofMicrobiologyResearch,2013,7(2)：89-97.131王成，汤德元，李春燕.等.日本乙型M炎病毒NSI基因及共疫苗的研究进JKUI.中国动物保健，2012.14(12)>16-19.141李春燕，沥德元，徐健，等.乙型脑炎的发制机理及冷力致祥机理的研充进展IJ1.中国件指杂志.2008(4),41-43,53.5AshokMS.RangarajanPN.mmunizationwithplasmidDNA

21、encodingtheenvelopeglycoproteinofJapaneseEncephalitisvirusconferssignificantprotectionagainstintracerebralviralchallengewithoutinducingdetectableantiviralantibodies|Jj.Vaccine,1999,Aug20(18(1-2):6875.|6AshokMS.RangarajanPN.ProtectiveefficacyofaplasmidDNAencodingJapaneseEncephalitisvimsenvelopeprotei

22、nfusedtotissueplasminogenactivatorsignalsequences：studiesinamurineintracerebralviruschallengemodc!(JVaccine,200220(1112)s!5631570.7ChangGJ.HuntAR,DavisB.AsingleintramuscularinjectionofrecombinantplasmidDNAinducesprotectiveimmunityandpreventsJapaneseencephalitisinmiceJ.Virol.2000.74(9),4244-4252.(8|KonoshiE,YamaokaM,Kuranc1.etal.Jap