乙酸发酵的建模和优化

1、乙酸发酵的建模和优化：基于多项式的方法Iens M. Santos-Due nas , Jorge E. Jimenez- Hornero , , Ana M. Ca nete-Rodriguez ,Isidoro Garcia-Garcia摘要：醋生产是农业食品工业范围内的典型生物过程。 它的优化需要仔细的建模，到目前为止主要通过使用非结构化的第一原理模型来解决。由于在获得这些模型中的困难，诸如这里使用的黑箱模型变得越来越频繁。在这项工作中开发的多项式模型，准确地反映了工业中用于该过程的主要的和典型的操作变量的影响。 此外，使用响应表面来鉴定最佳操作条件，以使平均发酵速率和生产率最大化。 遵

2、循的策略具有巨大的工业效益，因为产生一了种工具，其不仅允许根据不同的标准找到最佳操作条件，而且对于过程控制是有用的。据我们所知，这是第一次这些变量以这种方式相关。关键词：生物反应器 造型 优化 乙酸 醋酸菌 醋1. 介绍乙酸发酵作为生物技术-生理过程的优化已经成为近来许多研究的主题，特别是关于醋生产1-6。 影响乙酸菌生长和活性的变量的复杂相互依赖性导致了用于量化主要变量之间的关系的数学模型的发展。大多数这样的模型具有现象学或非结构化的第一原理基础11-14，并使用微分方程来平衡底物和产物浓度，以及动力学方程来定义不同变量的影响15,16。该方法的优点在于，由于其依赖于所涉及的方法的物理化学性

3、质，在宽范围的操作条件下是有效的。然而，其具有的缺点是所获得的模型是复杂的，并且必须构建它们的动力学方程，而未知的参数确定，必须通过应用优化算法估计其实验值17。此外，获得准确，明确的估计需要满足结构和实用的可识别性条件18-22。结构可识别性分析条件仅取决于模型方程的数学结构，而实际可识别性分析条件需考虑用于估计参数的数据及其质量。检查两个条件是否都满足需要使用计算复杂的算法23,24，这是第一原则模型的附加缺点。另一方面，黑盒模型不需要考虑目标过程背后的物理化学原理25。此外，这些模型寻求在不同条件下获得的实验值之间的操作变量和过程变量之间的最简单可能的关系。通常，黑箱模型比现象模型更容易

4、构建，并且不需要先前的可识别性分析，因此它们对于过程优化和控制更加实用。 然而，黑箱模型适用于比现象模型更窄的操作范围，因为它们必须是局部方法。多项式模型是最广泛使用的黑箱模型26,27之一，允许操作和过程变量通过变量顺序的线性或非线性广义多项式相关，但通常是第一或第二28,29 - 后者往往是更准确和广泛适用的因素（操作变量）之间的考虑互动的影响。然而，他们需要更多的实验数据来拟合系数;并且，所需的实验的数量取决于多项式阶数，因子的数量和用于离散每个因子范围的级别（值）的数量。实验设计用于识别在特定实验条件下最强烈影响过程的因素，最小化不受控制的因素（扰动）的影响，通过统计分析来分离和评估每

5、个个体因素的影响30，并且合理化所需的实验31。实验设计允许获得用于构造多项式模型的最简单的代数方程。联合使用多项式模型和响应面为过程优化提供了强大的工具1,6,32，因为它有助于识别一个过程的最佳操作条件，考虑各个影响因素之间的相互作用。在这项工作中，我们利用这些模型的优势来构建乙酸发酵过程变量的二次多项式。 为此，我们使用三个不同的因素，即：反应器在卸载时剩余的乙醇浓度，卸载体积百分比和反应器加载速率，这是工业最广泛使用的三个操作变量。 据我们所知，这是第一次这些变量已经以这种方式相关。随后的模型用于通过变量的响应面优化过程，并将结果与先前报道的第一原理模型的那些相比较。2. 材料和方法2

6、.1。 原材料或基材乙酰化底物是来自Montilla-Moriles地区的白葡萄酒，它是西班牙南部的保护原产地33。 该酒的初始乙醇浓度为11.7±0.3（v / v），酸度为0.2（w / v）。2.2。 微生物使用的接种物由来自完全操作（Deoleo S.A.，Córdoba，Spain）的工业槽的3L发酵液组成。2.3。 发酵条件实验在全自动8L Frings反应器（Heinrich Frings GmbHCo.，KG，Bonn，Germany）上进行，其细节可以在先前的工作中找到14,24,34-38。反应器在 半连续模式，以便于评估乙醇浓度在卸载时的影响，平均卸载

7、体积和葡萄酒加载速率对发酵速率和乙酸生产的影响。 使用31的恒温来模拟工业条件。卸载时的乙醇浓度为0.53.5（v / v），平均卸载体积为最终工作容积的26L的2575，负荷率为0.010.06Lmin-1 。反应器达到其最终体积（8L）时的空气流速为7.5L（hL-培养基)-1生物反应器被完全装备成以自动方式操作，因此通过适当的计算机软件加载，卸载和监测。 这种方法提供了高操作可重复性和详尽的数据记录。为了估计平均乙酸化速率，使用在其他地方提出的方法35，使用发酵周期中乙醇浓度的变化。表格1Box-Behnken实验计划中使用的控制因素及其水平。因素 代号 等级-1 0 +1乙醇在卸载时间

8、，（）（v / v） E 0.5 2 3.5卸载量（） V 25 50 75加载速率，Lmin -1 C 0.01 0.035 0.062.4。实验设计我们使用中央复合设计（即Box-Behnken设计）同时检查所有因素的影响，并尽可能减少所需的实验数量。需要总共15个不同的集合实验条件来表征所考虑的3个变量（参见表1和2）。无论如何，已经进行了巨大的实验工作;表2显示了每组实验条件的有用重复数（总数为176）。此外，每次修改操作条件时，可能需要可变数量的适配循环，直到获得重复结果。2.5。分析方法通过EJA 110差压测量探头（Yokogawa Electric Corporation，To

9、kyo，Japan）测量体积。通过使用Alkosens探针和传感器（Heinrich Frings GmbHCo.，KG，Bonn，德国）以连续方式监测乙醇浓度。通过用先前通过蒸汽蒸馏获得的介质中的乙醇计39测定乙醇来校准探针。通过酸碱滴定测量乙酸浓度39。通过使用光学显微镜在Neubauer室中直接计数来测定总细胞浓度，并且类似地使用LIVE / DEAD BacLight细菌活力试剂盒和显微镜的荧光单位测定活细胞浓度。2.6。数学方法通过建立Karush-Kuhn-Tucker（KKT）条件40,41来确定操作变量的最佳值，该条件将由非线性限制优化问题的最优点来满足。这里解决的问题定义如下

10、：Max f(x 1 ,x 2 ,.,x n )s.t. g 1 (x 1 ,x 2 ,.,x n ) 0g 2 (x 1 ,x 2 ,.,x n ) 0g 3 (x 1 ,x 2 ,.,x n ) 0 (1).g m (x 1 ,x 2 ,.,x n ) 0其中x i表示决策变量。 潜在最大值从以下拉格朗日函数获得： L=-f+i=1migi (2)其中i是KKT乘数，并求解下面的方程组： xL=-xf+i=1mixgi (3)igi= 0,i = 1,.,m表2Box-Behnken实验计划和反应在不同因素水平。实验 E，（）（v / v） V，（） C，Lmin-1 复制次数1 3.5

11、(+1) 75 (+1) 0.06 (+1) 82 3.5 (+1) 75 (+1) 0.01 (1) 103 3.5 (+1) 25 (1) 0.06 (+1) 134 3.5 (+1) 25 (1) 0.01 (1) 215 0.5 (1) 75 (+1) 0.06 (+1) 126 0.5 (1) 75 (+1) 0.01 (1) 87 0.5 (1) 25 (1) 0.06 (+1) 78 0.5 (1) 25 (1) 0.01 (1) 79 3.5 (+1) 50 (0) 0.035 (0) 1510 0.5 (1) 50 (0) 0.035 (0) 1011 2 (0) 75 (+

12、1) 0.035 (0) 712 2 (0) 25 (1) 0.035 (0) 1613 2 (0) 50 (0) 0.06 (+1) 1914 2 (0) 50 (0) 0.01 (1) 1115 2 (0) 50 (0) 0.035 (0) 12*括号中的数字是变量的标准化值。3. 结果表3显示了选择的过程变量的实验结果。 结果用于拟合每个变量的二次多项式模型。平均乙酸形成速率的方差分析（ANOVA）显示在99.9概率水平的显着差异。 因此，这个变量取决于所使用的操作条件，因此适用于多项式回归，其以三种形式应用，即：最佳子集回归，后向逐步回归和后向逐步回归。与Pare分析一起，这些过程揭示

13、了哪些 多项式项显着。 等式 （4）获得的平均乙酸形成率为0.01乙酸（100mLh)-1：(r A)est = 0.160 + 0.0443 × E + 3.47 × 10-4 × V 5.84 × 10-3 × E23.468 ×C2 2.33 ×10-4 × E × V (4)图1.估计与实验平均值的乙酰化率，95置信度和预测间隔。表3因变量的实验值可以看出，在统计学上有意义的术语中不存在一些操作变量（例如，反应器加载速率）。 另外，在操作变量的设定范围内。变量之间的一些相互作用对目标函数没有影响。

14、图1将实验值与其估计的对应值进行比较。 两组在9例中完全一致，在其他6例中差异为4.5-5.5。实验值和估计值之间的残差分析显示它们是正态分布的。等式 （5）获得用于在误差小于0.5g乙酸h -1的循环中乙酸的总生产：(p A)est = 10.36 + 3.344 × E + 0.118 × V 0.413 ×E2 1.01 ×10-3 × V20.02 × E × V (5)可以看出，乙酸生产完全独立于负载率。此外，实验值和估计值的比较和残余物的分析显示可接受的一致性。表3中其他变量的方程如下：(EtOH mean)es

15、t = 0.323 + 0.667 × E + 0.0556 × V (6)HAcmean = 9.959 0.627 × E 5.32 ×10-4 ×V2 (7)(TotalCellsmean)est = (2.4732 ± 0.1988) × 10 8 cells × mL-1 (8)(ViableCellsmean)est = = (2.2586 ± 0.2216) × 108cells × mL-1 (9)(Vmean )est = 7.766 1.09 ×10-4&

16、#215;V2 + 0.163 × V × C (10)(EtOH mean)est，HAcmean和(Vmean )est的预测误差分别为1.2（v / v），1.2（w / v）和0.3L。 关于细胞浓度，ANOVA显示在99.9概率水平的实验之间没有显着差异;这允许平均值表示为具有给定错误。4讨论在构建多项式模型之后，使用响应曲面来评估操作变量对于乙酸化性能的影响，并确定其最佳值。在工业实践中，要最大化的目标函数是平均乙酸形成速率(r A)est和乙酸生产(p A)est。4.1平均发酵速率 图2显示了作为卸载体积百分比（25-75）和加载速率（0.01-0.06L

17、/ min）的函数的卸载时间（0.5-3.5v / v） 如可以看到的，展示了未装载的体积影响显着，但总是取决于乙醇浓度。因此，当使用卸载时的乙醇浓度为3.5（v / v）时，最大乙酰化速率， 在卸载25的培养基后获得0.23g乙酸（100mLh)-1; 然而，如果乙醇浓度为0.5（v / v），则最大乙酰化速率较低， 当75的培养基被卸载时，获得略低于0.20g乙酸（100mLh)-1的值。 这些结果清楚地表明，操作变量的影响不是彼此独立的。还可以看出，降低反应器卸载到0.5（v / v）时的乙醇浓度导致比当使用底物时更低的平均速率，而与其他两个操作变量无关。  

18、0;  在任何情况下，平均速率很大程度上取决于与卸载体积有关的操作条件。因此，增加体积使峰值(r A)est值从3.5（v / v）的乙醇浓度移动到2 （v / v）。    另一方面，负载率几乎没有影响。事实上，这个变量只存在于方程中的交互项中。 （4），并且所述项在多项式中相对于其他项不是有效的。在任何情况下，在0.01Lmin-1的加载速率下总是获得峰值(r A)est值。   尽管响应表面显示出明显低的斜率，但在一些情况下最大和最小速率之间的差异是显着的。因此，这样的差异分别为在乙醇浓度为3.5,

19、2.0和0.5（v / v）时获得的最小值的18.2,8.9和13.6，并且可以导致相当大的生产成本差异。    这些结果清楚地表明操作条件对培养基中的变化的影响。具体地，条件可以对细胞浓度和/或其在乙酰化循环期间的活性具有直接影响。因此，可以参见图1。图3显示了活性细胞的平均浓度随着反应器卸载和卸载体积时剩余的乙醇浓度的变化，当乙醇浓度从3.5（v / v）降低时，细胞浓度似乎降低，至0.5（v / v），差异是统计学上的非重要的，如果提供实验误差 - 为了清楚和简单，图排除了每个点的标准偏差。每组实验结果（即，对应于25,50或75的未负载体积）由图

20、中所示的相同的平均值表示，并从等式1获得。（9）。然而，在乙酸化周期期间，活细胞浓度的最大值和最小值之间的差异随着卸载体积的减小而减小，并且与平均细胞浓度非常相似 - 接近伪稳态。因此，通过增加细胞更新的作用，75的未加载体积的这些差异更大。因此，当细胞浓度在任何时间（即，具有低的未加载体积）下与它们的平均值相似时，由于较小的细胞更新，操作条件对乙酸化性能具有更显着的影响。在这种情况下使用远离理想的操作条件可能对细胞行为具有严重的不良后果。这可能是为什么在卸载时间为0.5（v / v）的乙醇浓度下，以25的卸载体积获得的平均乙酸形成速率是最低的。另一方面，大的细胞更新（即，高卸载体积）导致发酵

21、速率相似（参见图2），并且相应的斜率在最佳（3.5或2（v / v） ）乙醇）和最差条件（在0.5（v / v）乙醇下卸载）。   最终，上述的差异由于乙醇和乙酸浓度的差异而增强，其受到操作条件的影响.A扫描从图1可以看出。参考图4，其示出了方程式（6），减少反应器卸载时剩余的乙醇浓度导致平均乙醇值降低，但乙酸值增加（方程（7）。此外，在反应器卸载时剩余的每个乙醇浓度，平均乙醇和乙酸浓度之间的差异随着卸载体积的增加而增加。因此，当卸载75的培养基时，在卸载时间的乙醇浓度为3.5,2.0和0.5时，平均乙醇浓度相对于平均最小值的变化百分比为68.2,90.7和135

22、.4（v / v）类似地，乙酸的变化百分比为56.2,46.9和40.2。所有这些结果只是已知的乙醇和流体的确认乙酸对乙酸菌的生长10。另一方面，从图10可以看出，如图4所示，加载速率对乙醇和乙酸的平均浓度没有影响。图2.在最终乙醇浓度为3.5（黑色网格），2.0（固体）或0.5（v / v）（白色网格）的情况下估计的平均乙酸化速率作为未负载体积和负载速率的函数。事实上， 2-4暗示这两种化合物影响细胞浓度和活性，因此影响该方法的所有性能。因此，乙醇浓度的降低和乙醇浓度下的平均酸度增加的0.5（v / v）导致相对于其它操作条件的平均发酵速率显着降低。以前与其他模型10,42-45也观察到由于

23、高产物浓度的底物稀缺和抑制的限制作用。然而，在反应器卸载时间具有不太显着的乙醇耗尽，底物可获得更大量和酸的浓度较低，这似乎促进了通过观察到的高平均乙酸形成速率来判断的方法。如图2所示，效果显着取决于特定的未负载体积。因此，该速率在乙醇浓度为3.5时达到峰值，无负载体积为25，但在2（v / v）与75之一。这些结果可归因于当相对于2（v / v）允许以3.5（v / v）卸载时达到增加的平均浓度的乙醇的潜在抑制作用（参见图4）;同样，与乙醇和乙酸对发酵速率的影响的非结构化建模获得的以前结果一致2,10,14,24,46。 图5显示了微生物发酵（即，导致最高发酵速率的那些条件）的最佳条

24、件是涉及平均乙醇浓度约为 4-5（v / v）（即，平均乙酸浓度为7-8（w / v）。 这些结果与以前的优化研究的结果一致46.通过使用涉及应用上述KKT条件（参见第2.4节）的限制性优化程序，更准确地计算要使用以便最大化(r A)est的每个操作条件的值。为此，目标函数（方程（4）经受以下约束：0.01 C 0.060.5 E 3.525 V 75以上可以写为：0.01 C 0C 0.06 00.5 E 0E 3.5 025 V 0V 75 0可以看出，(r A)est函数是可微分的，并且相对于决策变量的Hessian矩阵是恒定的和负半定的。 此外，先前的限制对于决策变量是不同的和线性的，

25、因此它们也是凸的和凹的。 因此，对必要的KKT条件的解决方案（如果有的话）应该与最大值一致。为了最大化， （3）用于构建以下系统的方程，以识别关键点：(0.0443 11.68 × 10-3 × E 2.33 × 10-4 × V) 3+4 = 0(6.936) × C 1+2 = 0(3.47 × 10 4 2.33 × 10 4 × E) 5+6= 01 (0.01 C) = 02 (C 0.06) = 0 (13)3 (0.5 E) = 04 (E 3.5) = 05 (25 V) = 06 (V 75) =

26、 0以这种方式，获得总共21个解决方案，其中只有一个满足KKT条件，即涉及以下操作变量值：E = 3.29%(v/v)C = 0.01 Lmin-1V = 25% (14)这导致0.23g乙酸（100mLh)-1的峰值。图3.在不同的未加载体积和最终乙醇浓度下的活细胞浓度。图4.在最终乙醇浓度为3.5（黑色网格），2.0（固体）或0.5（v / v）（白色网格）的平均乙醇浓度作为卸载体积和负载速率的函数。图5.估计的平均乙酸化速率作为在0.01,0.35或0.06Lmin -1的负载速率下的平均乙醇和乙酸浓度的函数4.2乙酸生产虽然确定过程的平均发酵速率对于评估操作变量的影响是重要的，但在工业

27、实践中，检查乙酸生产的影响可能更有用。 由此得出的结论不必相同，因为平均发酵速率取决于平均反应器体积，反过来取决于操作条件（参见式（10）。 在任何情况下，两者通过以下等式相关PA=HAc final × Vttotal rA=PAV mean (15)图6显示出了在研究的操作范围上的(P A)est（参见等式（5）的响应面。 可以看出，加载速率对乙酸生产没有影响 - 这从等式（5）非常明显，其不包含相关项。 此外，在卸载时间（3.5（v / v）和最低卸载体积（25）的最高乙醇浓度下获得乙酸的最大产量（约17.6g乙酸h -1）。然而，如果考虑估计误差，则最大化乙酸产量的未装载体积

28、高达40。 如果主要目的是最大化生产，则上述操作条件是非常合适的。 然而，取决于要获得的特定类型的醋，可能需要对某些变量如在反应器卸载时保留的乙醇浓度施加限制。例如，在0.5的乙醇浓度下卸载反应器 v / v）减少最大可能的乙酸产量，获得值。 14.8g乙酸。 然而，该峰值可以在宽范围的未负载体积（35-65）上获得。与平均发酵速率一样，我们在操作范围内确定最佳乙酸产量。用于此的目标函数是(P A)est（Eq。（5）和通过方程式施加的限制除了第一和第二约束，子集（12），因为变量独立于加载速率。目标函数的海森矩阵是恒定的和负定的; 同样，显然，约束的结论与平均发酵速率的结论相同。用于识别最大

29、值的方程系统如前述情况构造，并产生9个解决方案，其中只有一个满足KKT条件：E = 3.44%(v/v)V = 25% (16)这导致17.58g乙酸h -1的峰(P A)est值图6.在最终乙醇浓度为3.5（黑色网格），2.0（固体）或0.5（v / v）（白色网格）的情况下作为加载速率和未加载体积的函数的估计生产速率。4.3 与其他建模方法的比较在以前的工作中，我们的小组开发了基于平衡和动力学方程46的第一原理模型，随后用于确定最佳操作条件2,14,24;结果提供的结果类似于在这项工作中达到的结论。在以前的工作中使用的方法具有的优点是，其提供对过程的基础机制的更深入的了解，并且在更广泛的操

30、作范围内。然而，与多项式方法不同，它的缺点是模型参数更难以检查，确定和处理。因此，确保模型参数可以明确地从等式结构获得，需要验证模型具有结构可识别性。这需要使用复杂的算法14,47。此外，模型不得不检查实际可识别性，这需要额外地评估可用的实验数据的量和它们的质量。提出的方法被发现不是全球性的，而是仅局部的，可识别的2。然而，这不会使其在特定操作范围内用于表示和优化目的。这些结果进一步验证了以前的模型，通过相当不同的方法构建。 因此，基于所比较的两种类型的模型的估计之间的高一致性，多项式模型由于其简单性和更容易的数学处理而优选用于实际目的。5结论在这项工作中，我们审查了乙酸发酵过程中工业兴趣的主

31、要操作变量（即乙醇浓度在当时有人被卸载，卸载体积和卸载速率）的影响，以优化操作条件在平均发酵速率和乙酸生产方面。为此，使用允许开发通过多项式方程关联过程和操作变量的黑箱模型的实验设计。目标变量另外包括平均乙醇和乙酸浓度，平均体积和平均总和活细胞浓度。在所得到的方程中交互项的存在证明了变量之间的相互关系。通过检查它们的响应面来确定变量的最佳值，并将结果与在最佳条件下的数学方法的结果进行比较。 乙酸形成的最大平均速率，在卸载时间为3.5（v / v）的乙醇浓度，25的卸载体积和0.01Lmin-1的加载速率下获得0.23g乙酸（100mLh)-1，然而，几乎没有影响。乙酸产量与加载速率无

32、关。因此，产量达到峰值。 17.6g乙酸h-1，其在接近最大乙醇浓度（3.5（v / v）和低无负载体积（25）下获得。将所提出的建模方法及其提供的最优值与包括基于平衡微分方程，动力方程和平衡方程的非结构化方法的先前研究进行比较。 它们的预测的一致性为两个模型提供了进一步的验证。 然而，在实践中，多项式模型将促进数学处理（特别是关于参数估计）。应当注意，目标过程是一个典型的例子，因此随后的结论可能适用于其他类似的生物技术过程。致谢作者希望承认西班牙科学技术部（MCyT），教育和科学部（MEC）在AGL2002-01712项目，PET2006 0827项目和安达卢西亚安达卢西亚大学和科尔多瓦大学

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