泡菜纯种发酵优良乳酸菌的筛选及菌株特性研究_图文

1、泡菜纯种发酵优良乳酸菌的筛选及菌株特性研究张冬梅,于康宁,涂 强,艾 方,彭丽桃*(华中农业大学食品科技学院,湖北武汉430070摘 要:从不同时期的新鲜泡菜汁中分离得到18株乳酸菌,筛选出2株发酵萝卜产酸能力强、风味好、亚硝酸盐含量低的菌株,经鉴定分别为肠膜明串珠菌肠膜亚种和戊糖乳杆菌。对这2株菌生长特性的测试结果表明:2株菌的生长温度范围较宽,最适生长温度均为37e ,最适生长p H 值均为68,肠膜明串珠菌对酸度和盐度的耐受性比戊糖乳杆菌差,肠膜明串珠菌在p H 值<4和盐浓度>8%时生长停滞,戊糖乳杆菌能够耐受p H 值<3和盐浓度>8%的生长条件。肠膜明串珠菌

2、和戊糖乳杆菌在MRS 培养基中对初始亚硝酸盐的降解率分别为84196%和93117%。关 键 词:泡菜;肠膜明串珠菌;戊糖乳杆菌;筛选;特性中图分类号:TS20113 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(200816-0022-04Isolati o n ,i d entification and characteristics of lactic acid bacteria from picklesZ HANG Dongme,i YU K angni ng ,TU Q i ang ,A I Fang ,PENG L itao *(Colle ge of Food Science a

3、nd T echnology,H uazhong Agr icultural Uni versit y,Wuhan 430070,China Abstract :18Strai ns o f lacti c aci d bacteri a were isolated and i dentifi ed fro m pickli ng cabbage and radi sh duri ng vari ous fer m ent ati on stages 1Two strai ns were se l ected f or havi ng excellent character i stics i

4、 n aci d producti on ,fer mentati on flavor and lo w nitrite concentra ti on when pickli ng radis h 1These t wo stra i ns were i dentifi ed as Leuconostocmese nteroi des subsp 1M ese nteroi des and Lactobacill us pent osus 1The characteristi cs of strai nswere a l so i nvesti gated 1The stra i ns co

5、uld tolorate a w i de range o f te mperat ure ,t he optm i al gro w th situati on f or t he m were at37e and at p H 6-81Lact obacillus pent osus had better ability o f aci d and sa lt y tolerance than Leuconost ocm esenteroi des ,Le uconostoc mese nteroi des coul d grow when p H val ue i s under 3or

6、 cont ent of salts i s up to 8%,while Lact obacillus p e ntosus coul d not grow when p H va l ue under 4or content of salt up t o 8%1Leuconost ocmesenteroi des and Lact obacillus pentosus depl eted 84196%and 93117%of the ini ti a l nitrite present i n deM an ,Rogosa and Sharpe brot h culturalmedi u

7、m ,respective l y 1K ey words :pi ck l es ;Le uconostocm esente roi des ;L actobac ill us pent osus ;i solati on ;characteristics收稿日期:2008-06-17作者简介:张冬梅(1984-,女,硕士,研究方向为食品加工;彭丽桃*,通讯作者,E-m ai:l penglt 12m ail 1h z au 1edu 1cn 。泡菜是一种传统的乳酸发酵蔬菜制品,富含乳酸菌活菌和乳酸,对人体的健康有益,不仅能有效抑制肠道中腐败菌的生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用,同时有降低胆

8、固醇等保健和医疗作用,深受人们的喜爱1。传统的泡菜制作方式都是采用自然发酵法,但由于乳酸发酵缓慢,发酵周期较长,酸味较弱,受环境因素影响大,产品质量不稳定,同时,在泡菜加工过程中极易积累亚硝酸盐、亚硝胺、亚硝基化合物等有害物质,给产品带来较大的安全性问题。乳酸菌是泡菜中主要起作用的菌群,在发酵过程中,乳酸菌产生大量的乳酸,使环境p H 降低,抑制有害微生物的生长。同时有些乳酸菌还有亚硝酸盐降解能力。YAN P M 等2(2008年研究发现,在发酵泡菜中分离出的戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌和发酵乳杆菌在MR S 培养基中可以分别降解9916%、9913%、9912%、9710%

9、、9815%和9818%的初始亚硝酸盐含量。GENCCELEP H 等3(2007年认为,添加了乳酸菌的发酵过程和自然发酵相比,腐胺,尸胺和苏胺等生物胺含量均有所降低4。乳酸菌生长代谢所产生的许多物质如乳酸、醋酸、甘露醇、2-庚酮等又可增强产品风味5。因此,为实现泡菜工业化生产,纯种发酵是一种较佳的选择。不仅可以克服自然发酵的诸多不足,而且可以提高泡菜生产的技术水平和产品质量档次。本试验以萝卜,甘蓝等为原料进行自然发酵制作泡菜,从中筛选出适宜纯种发酵萝卜的乳酸菌,为泡菜工业化生产提供参考。1材料与方法111试验材料萝卜、甘蓝等购于华中农业大学农贸市场(萝卜为白萝卜,甘蓝为普通甘蓝,洗净,切分。

10、112乳酸菌的分离以萝卜,甘蓝等为原料,5%的盐水制作自然发酵泡菜,在发酵的前期、中期、后期分别取泡菜汁进行梯度稀释,用加有1%Ca CO 3灭菌的MRS 培养基倾倒深层平板,30e 恒温培养2d3d ,挑取有溶钙圈的菌落,平板划线纯化至单菌落6。对分离纯化所得的菌株分别进行革兰氏染色,接触酶试验,发酵葡萄糖产酸产气试验,乳酸纸层析试验和氨基酸脱羧酶试验7;对革兰氏染色阳性,接触酶阴性,发酵葡萄糖产酸阳性,乳酸纸层析阳性,氨基酸脱羧酶阴性的菌株4e 下保存,弃去不符合条件的菌株。113乳酸菌的筛选发酵萝卜工艺路线:萝卜y洗净y晾干y切分y用5%的盐水浸泡y25e发酵3%接种量接种11311发酵

11、产酸情况用酸度计于24h、48h、72h测定发酵液p H值。11312发酵产品亚硝酸盐的测定72h发酵成熟后,用盐酸萘乙二胺法8测定发酵萝卜中亚硝酸盐的含量。11313感官评价根据发酵萝卜的色泽、香味、味觉和口感,参照表1的标准,组成5人评定小组评定发酵成品。表1感官评分标准Tabl e11St andards of sensory evaluation感官项目好较好一般差色泽(20分白色透明(1820分颜色微黄(1417分色泽偏黄(1113分颜色混浊(810分香味(25分浓郁的发酵清香(2225分萝卜的清香味(1821分芳香较淡(1417分无芳香,有刺激气味(1013味觉(25分酸咸味适中(

12、2125分酸咸味较浓或较淡(1720分酸咸味偏高或偏低(1416分过酸过咸(1013分口感(30分脆嫩,细腻(2530分较脆,较细腻(2024分软脆适中,没有质感(1519分软,粗糙(15分以下114筛选菌株的鉴定11411形态特征鉴定菌落形态:观察分离培养基平板上菌落形态。菌体形态:将所分离的菌株进行革兰氏染色,于油镜下观察菌体形态,记录观察结果。11412生理生化特征鉴定测试菌种各种碳源发酵情况,是否产生H2S等特殊生理特征试验,进行菌株15e、37e生长试验并记录结果。115筛选菌株的特性11511生长曲线的测定以不接菌的空白培养基为对照,30e恒温培养,每隔2h在波长600n m处测定

13、M RS培养液的OD值。11512耐酸和耐盐的测定分别将M RS培养基调不同的p H值(2、3、4、5、6、7、8、9和盐浓度(0%、2%、4%、6%、8%、10%,接入已经活化好的菌株,30e恒温培养14h后在波长600n m处测定其OD值。11513最适生长温度测定将活化好的菌株接种于MR S培养基中,分别于25e、30e、35e、37e、40e培养10h后在波长600n m处测定其OD值。11514降解亚硝酸盐能力测定以无菌水代替亚硝酸钠溶液为空白对照,将2株乳酸菌活化培养后,接种到装有1mL1000L g/mL亚硝酸钠溶液和9mL液体培养基的试管中,30e恒温培养72h。按上述方法测定

14、培养基中残存的亚硝酸盐。2结果与分析211乳酸菌的分离在不同发酵时期的新鲜泡菜汁中分离出有溶钙圈的菌株32株,其中筛选出革兰氏染色阳性、接触酶阴性,发酵葡萄糖产酸阳性,乳酸纸层析阳性,氨基酸脱羧酶阴性的菌株18株,编号为1#18#。212乳酸菌的筛选通过发酵产酸情况,发酵萝卜中亚硝酸盐含量及感官评定,依次对所分离的乳酸菌进行筛选。21211发酵产酸情况乳酸菌的产酸速度对得到优质安全的泡菜非常重要,特别是在发酵初期,p H值的迅速降低能有效抑制其他不耐酸杂菌的繁殖,从而减少有害代谢产物的积累。将所筛选的18株乳酸菌进行纯种发酵萝卜试验,24h、48h、72h后测定其发酵液的p H值,结果见表2。

15、筛选出1#、2#、6#、7#、8#、9#、10#、13#、18#共9株乳酸菌,在单独发酵萝卜泡菜48h内p H值均降到3150以下,产酸速度快,适合纯种发酵泡菜。表2不同菌株发酵时pH值随时间变化Table21changes of pH value i n cult ural mediu m duri n g f er ment ation w ith vari o us strains21212发酵产品亚硝酸盐含量亚硝酸盐的产生主要是由于发酵初期杂菌(肠杆科细菌和真菌等的硝酸还原作用,大量硝酸盐被还原成亚硝酸盐1乳酸菌可以抑制硝酸还原杂菌的生长,另外,乳酸菌代谢产生的乳酸和自身的酶系统,可以

16、使相当一部分亚硝酸盐被降解9。发酵72h后,测定所筛选出的9株产酸快的乳酸菌纯种发酵萝卜中的亚硝酸盐含量,结果见图1。筛选出6#、7#、8#、10#共4株亚硝酸盐含量低的乳酸菌株。21213感官评价(见表3通过色泽、香味、味觉和口感的感官评价,最终筛选出7#和10#2株乳酸菌。这2株菌纯种发酵萝卜时,质地脆嫩,酸味适中,口感好。 图1不同菌株发酵萝卜中亚硝酸盐含量F i g ure 11N itrite concentrations in pick ling radishs f er ment edw it h vari o us strains表3萝卜泡菜感官评定结果Table 31Sens

17、ory evaluati o n of rad ish pickle感官项目6#7#8#10#色泽18?0101617?0131813?0131817?013香味2117?01323?0161617?01922?112味觉20?0162017?0171617?0192117?013口感23?0162613?0191717?1122613?113总分8217?1128617?1156914?2178816?217213筛选菌株的鉴定21311形态特征鉴定对筛选出的7#、10#菌株进行形态特征鉴定的结果见图2。由图2可知,7#菌株菌落形态为圆形,乳白色,扁平,光滑圆整,直径015mm 215mm,

18、菌体形态为球形,单个、成对或成链。10#菌株菌落圆形,乳白色,突起,光滑圆整,直径015mm 2mm, 菌体形态为杆状。图27#(A和10#(B菌株细胞形态观察结果F i g ure 21Morphol o g ical f eatures of No 17and No 110strains21312生理生化试验2株菌的精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱氢酶试验均为阴 性,均不产生H 2S ,7#菌在15e 和37e 下均生长,10#菌在15e 下不生长,37e 下生长。各种碳源发酵情况见表4。表4碳源利用情况Tab l e 41M et abolism of carbohydrat es by No

19、7and No 10strains 碳源7#10#碳源7#10#L -阿拉伯糖-+麦芽糖+蔗糖+蜜二糖-+乳糖-+半乳糖-+葡萄糖+海藻糖+果糖+鼠李糖+甘露醇-+核糖-+甘露糖+D -木糖-+参考5伯杰氏细菌鉴定手册610和5乳酸细菌-基础、技术和应用611,初步鉴定7#为肠膜明串珠菌肠膜亚种,10#为戊糖乳杆菌。其中7#肠膜明串珠菌来自发酵初期泡菜汁,10#戊糖乳杆菌来自发酵末期。214筛选菌株的特性21411菌株生长曲线及p H 值变化曲线(见图3图3接种菌液OD 600值(A和pH 值(B随培养时间的变化F i g ure 31Changes in O D 600value(Aan d

20、 pH va l u e (B of MRS cult uralmediu m duri n g f er menti o n w it h No 17and No 110strains2株菌均具有良好的生长特性和产酸能力,7#肠膜明串珠菌的生长周期较短,培养12h 后进入稳定期,在波长600nm 处培养液的OD 值达到11534。培养液初始产酸速度较快,但是产酸量低,培养24h 后p H 值降低到4150左右,48h 后降低到4140,之后不再降低。10#戊糖乳杆菌培养18h 后进入稳定期,波长600nm 下培养液的OD 值可达到11875,而且产酸速度快,产酸量大,培养24h 后培养液p

21、H值降低到3190左右,继续培养p H 值最低可降低到3170。21412菌株对不同盐浓度和p H 值的适应性由2株菌在不同p H 值培养基的生长情况(图4可以看出,7#肠膜明串珠菌和10# 戊糖乳杆菌的最适生长p H 值均为68,7#肠膜明串珠菌的生长受p H 值限制较大,在p H 值低于4时不生长。所以肠膜明串珠菌只能在发酵初期的泡菜汁中分离获得,随着发酵液p H 值的降低,肠膜明串珠菌迅速减少直至全部死亡。10#戊糖乳杆菌耐酸性强,在p H 值低于3时也能生长。该菌从属于植物乳杆菌,是发酵后期的优势菌种,在较低的p H 值下能够继续生长产酸,使泡菜发酵成熟。 图4不同p H 值条件对菌株

22、生长的影响F igure 41E ff ec t s of diff erent initi a l pH value in MRS cultural med-iu m on gro w th o fNo 17and No 110strains由图5可以看出,7#肠膜明串珠菌的生长受盐浓度限制较大,盐浓度越高,菌株生长速度越慢。而对于10#戊糖乳杆菌菌,低浓度(2%的N a C l 反而有利于菌株的生长,随着盐浓度的增加,菌株的生长同样受到限制。当盐浓度在4%时,2株菌仍能良好生长,当盐浓度达到8%时,7#肠膜明串珠菌生长停滞,10#戊糖乳杆菌生长缓慢(图5。 图5不同盐浓度对菌株生长的影响F

23、 i g ure 51Eff ects of diff erent concentration o fNa C l inMRS cult ur -al mediu m on gro w th ofNo 17and No 110strains21413温度对菌株生长的影响2株菌的生长温度范围较宽,最适生长温度均为37e ,在所选的25e 40e 的测试范围内,2株乳酸菌均能良好的生长。2株菌在不同温度下的产酸能力不同,由图6可见,2株菌的产酸能力和生长速度相一致,在最适生长温度时产酸也最强。尽管如此,在实际生产中并不提倡在菌株的最适温度下发酵,因为产酸过快使发酵过程不易控制,容易导致过酸,一般采

24、用25e 左右发酵较合适12。图6不同培养温度下7#和10#菌株培养基OD 600值(A和pH 值(B的变化Figure 61The OD 600val u e(A an d pH va l u e(B in MRS cultural med i u msw ith No 17and No 110strains under diff erent t e mperat ure21414菌株对亚硝酸盐的降解能力试验测得所筛选的肠膜明串珠菌和戊糖乳杆菌对初始含量为100L g /mL 的亚硝酸盐溶液的降解率分别为84196%和93117%,所筛选的菌株对亚硝酸盐的降解能力较高,适合纯种发酵,对提高发

25、酵产品的安全性有重要意义。3结论以萝卜、甘蓝等为原料自制泡菜,在不同发酵时期的新鲜泡菜汁中分离出18株乳酸菌,通过产酸速度、发酵产品的亚硝酸盐含量和发酵风味进行筛选,得到2株适合纯种发酵的乳酸菌,经鉴定为肠膜明串珠菌肠膜亚种和戊糖乳杆菌。2株菌均具有良好的生长特性和产酸能力,最适生长p H 值均为68,最适生长温度均为37e 。所筛选的肠膜明串珠菌生长受p H 值和盐浓度限制较大,在p H 值<4和盐浓度>8%时不生长,戊糖乳杆菌能够耐受p H 值<3和盐浓度>8%,2株菌对初始亚硝酸盐的降解降解率分别为84196%和93117%,其中戊糖乳杆菌对亚硝酸盐的降解能力更强

26、。参考文献:1CAPL I CE E ,FI TZ GERALD G F 1Food fer m entations :ro l e ofm i croorgan-i s m s i n food producti on and Pres ervati on J1Internati onal Journ al of Food M icrob iol ogy ,1999,50(1-2:131-14912YAN P M,X UE W T,TAN S S ,et al 1E ffect of i noc u lati ng l actic aci dbacteria starter c u ltur

27、es on the n i trite con centrati on of f er m enti ng Ch i nes e牛肉风味强化肽(B M P在毕赤酵母中的高效分泌表达白小佳,高文,王艳萍*(天津科技大学食品工程与生物技术学院天津食品营养与安全重点实验室,天津300457摘要:牛肉风味强化肽(Beefy M eaty Pepti de,B MP是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到的一种风味强化八肽,与食盐、M S G有较好的协同呈味的作用,能增强鲜味。将B M P串联基因整合在毕赤酵母GS115基因组中,获得工程菌株P1past oris GS115-4B M P、P1pastor

28、is GS115-8B M P、P1pastoris GS115-12B M P和P1pastoris GS115-16B MP。将工程菌在B MMY培养基中诱导表达后的蛋白抽提物利用T ri c i ne-S DS-PAGE 电泳检测,结果表明:构建的工程菌可以高效表达4拷贝、8拷贝、12拷贝和16拷贝的B M P,为B M P的高效表达和制备奠定了良好的基础。关键词:牛肉风味强化肽;毕赤酵母;串联基因;表达中图分类号:TS20113文献标识码:A文章编号:0254-5071(200816-0026-03H igh Level Secretion Expression of Beefy M

29、eat y Peptide Gene i n P1pastorisBa iX iao jia,G ao W en,W ang Y anping*(D e p ar t m ent of Food Eng i neering&B iotechnology,T i anj i n K ey Laboratory of Food nutrition&safet y,T ianjin University of Science&T echnology,Chi na,300457Abstract:Beef y M eaty Peptide(B MPi s an octapepti

30、 de w i th delici ous taste and w as i solated fi rst from beef di gested by Papa i n1There were s ynerg isti c effects of salt andM S G on B M P and B M P can be us ed as a nat ura l fl avor enhancer li keM S G1I n t hiswork,tande m genes of B M P were s uccessf ull y i ntegra-t ed i nt o the geno

31、m e of P1past oris GS1151R eco mbi nants we got w ere denoted as P1past oris GS115-4B M P,P1past oris GS115-8B MP,P1pastoris GS115-12B M P and P1past oris GS115-16B MP,res pecti vely1These strai nswere i ncubated and t hen i nd uced i n B MMY f or expressi on of B M P and total protei n i n t he s u

32、pernatantwere extracted and analysised by Tr i c i ne-S DS-PAGE,res ults s hown t hat a ll the stra i n constracted coul d expressB MP of4copy,8copy,12cop-y and16copy effi c i entl y1Th i s work lai d t he f oundati on for effective l y expressi on and preparati on of t h i s flavor enhancer1K ey wo

33、rds:beef y meaty peptide;P1past oris;t ande m genes;expression牛肉风味肽(Beefy M eaty Pept i de,B M P最初是由YA-M ASAK I Y等1从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离出来的,其一级结构为:N-Lys-G l y-A sp-G l u-G l u-Ser-le u-A la-C,分子量为847Da,通过ExPasy软件预测等电点为411。B M P 是牛肉风味的主要成分之一,能产生类似/美味肽0的风味和阈值2。WANG K等3研究表明BM P与食盐、M SG有较好地协同呈味的作用,能增强鲜味。WANG K等4报道化学合成的B M P在p H615的条件下,经过121e、20m i n的热处理表现出很好的热稳定性,仅有10%变性,适合于食品工业生产中的热处理要求,并推测可能由于BM P是一种线性短肽,不存在高级结构,而其组成的氨基酸具有耐热性。目前,风味肽