烟草中NAC类转录因子基因的克隆及分析_图文

1、中国农业科学 2011,44(11:2225-2233 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.11.003烟草中NAC 类转录因子基因的克隆及分析戚元成1,2，王菲菲，刘卫群21,2，高美娟2（1河南农业大学国家烟草栽培重点实验室，郑州 450002；2河南农业大学生命科学学院，郑州 450002）摘要：【目的】克隆烟草NAC 类转录因子基因，分析其序列特征和表达特性，为深入研究NAC 类转录因子对烟草打顶后根系的生长发育与烟碱生物合成之间的关系奠定基础。【方法】采用电子克隆结合RT-PCR 获得烟草NtN

2、AC-R1全长cDNA 序列，并进行生物信息学分析，用pRESTB 原核表达系统进行该基因的原核表达。分别采用RT-PCR 和Northern 杂交对烟草打顶前、后根尖组织中NtNAC-R1的表达模式进行分析。【结果】烟草NtNAC-R1开放性阅读框架长度为936 bp，编码311个氨基酸，具有NAC 转录因子家族典型的保守结构域。系统进化分析表明，该基因与矮牵牛NAC 亲缘关系较近，属茄科植物特异NAC 家族，在原核细胞中具有表达活性。该基因在烟草根中的表达水平最高，在烟草打顶后24 h表达水平下降，随后上升。【结论】从烟草根尖组织中克隆了一个NAC 转录因子基因NtNAC-R1，该基因在根

3、系中具有高水平表达，在烟草打顶后24 h表达水平显著降低，具有响应烟草打顶所导致的信号传递作用。关键词：烟草；NAC类转录因子；RT-PCR；Northern杂交；组织表达Cloning and Analysis of NAC Transcription Factor in Tobacco（Nicotiana tabacum L. ）QI Yuan-cheng1,2, WANG Fei-fei2, LIU Wei-qun1, 2, GAO Mei-juan2(1Key Laboratory of National Tobacco Cultivation, Henan Agricultural

4、University, Zhengzhou 450002; 2College of Life Science,Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002Abstract: 【Objective 】Cloning and characterization of tobacco NAC transcription factor gene could provide a foundation for studying its function and relationship between the root development and nic

5、otine biosynthesis after tobacco topping. 【Method 】 The full-length cDNA sequence of NtNAC-R1 was amplified by in silico cloning and RT-PCR, and was expressed in Escherichia coli BL21. The expression pattern of NtNAC-R1 in root before and after tobacco topping was analyzed by RT-PCR and Northern blo

6、tting. 【Result 】 NtNAC-R1 had an 936 bp open reading frame in length, encoding 311 amino acids, with a typical conserved domain of NAC transcription factor family. Phylogenetic analysis showed that NtNAC-R1 had the highest homology with the NAC domain in Petunia and belonged to special NAC family in

7、 Solanaceae . This novel gene showed expression activity in prokaryotic cells. NtNAC-R1 had a highest expression level in root, with a decreased expression level at 2 h and 4 h after topping, then rose.【Conclusion 】NtNAC-R1 was isolated from tobacco root, and it showed higher transcript levels in th

8、e roots, and significantly decreased after 2-4 h of tobacco topping, indicating the NtNAC-R1 can play an important role in the signal transduction of tobacco topping.Key words: tobacco (Nicotiana tabacum L.; NAC transcription factor; RT-PCR; Northern blotting; tissue expression收稿日期：2010-11-03；接受日期：2

9、010-12-27 基金项目：国家自然科学基金（30971704）联系方式：戚元成，E-mail ：qiyuancheng。通信作者刘卫群，Tel E-mail ：liuweiqun20042226 中 国 农 业 科 学 44卷0 引言【研究意义】1997年，Aida 等1首先报道了NAC 结构域，发现在矮牵牛NAM （No Apical Meristem）、拟南芥ATAFl/2和CUC2（cup-shaped-cotyledon ）编码蛋白的N 端包含一段保守的氨基酸序列，取3个基因首字母命名为NAC 。NAC 转录因子是植物特有的植物在生长发育过程中最大的转

10、录因子家族之一2-3。经常受到如干旱、高盐、低温、病原菌等各种生物和非生物胁迫，通过一系列的信号传递，激发转录因子的产生，转录因子与相应的顺式作用元件结合，激活下游逆境相关基因的表达，最后通过基因产物的作用对外界信号在生理生化等方面作出适合的调节反应。由此可见，转录因子在基因的表达调控中起关键作用。烟碱是烟草特有的生物碱，是烟草根系合成的次生代谢产物。烟碱除了用于吸食，也广泛用于生物农药、医药和化工产品。因此，克隆烟草NAC 基因对于研究调控烟碱生物合成的分子机制有重要意义。【前人研究进展】目前，功能研究已经证实NAC 在植物发育和生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色。Souer

11、 等4从矮牵牛中克隆第一个NAC 转录因子NAM ，NAM 突变体可导致幼胚及根尖分生组织难以形成。Aida 等1发现在拟南芥CUCl 和CUC2双基因突变体中，子叶、萼片和雄蕊的分离以及顶端分生组织的形成方面有缺陷。Xie 等5发现拟南芥NACl 受生长素诱导并且过表达该基因的转基因植物侧根增ABA （abscisic 多。He 等6发现拟南芥AtNAC2受高盐、acid ）、ACC （aminocyclopropane carboxylic）和NAA （naphthalene acetic acid）的诱导表达。Tran 等7采用酵母单杂交技术从拟南芥中分离到3个不同的NAC （ANAC0

12、19、ANAC055和ANAC072），它们的表达受干旱、高盐和ABA 的诱导。目前，对NAC 转录因子的研究主要集中在拟南芥和水稻等少数植物上，已有试验证明，不同物种的高同源性NAC 可能具有不同的功能特点。例如拟南芥ATAF2和油菜（Brassica napus ）BnNAC5-8同属ATAF 亚家族，但转ATAF2的植株地上部生长旺盛，而转BnNAC5-8的植株地上部分则发育不良8-9。已经发现打顶（去除顶端生长组织和相邻近的几片叶）后烟株根系合成烟碱的能力显著增强10-12。Shoji 等13认为打顶是一种伤害刺激，引起JA 含量增加，促进了根系烟碱的生物合成。Shi 等14采用不同方

13、式的机械损伤对烟碱合成的影响做了比较，认为打顶导致烟碱含量升高的原因主要在于去掉顶端分生组织以后所造成的生长素源的变化。烟碱的生物合成部位是烟草根系，打顶后，根系进入一个迅速生长状态，烟碱生物合成能力也显著增强，而NAC 类转录因子对根系的发育，尤其是根尖组织的发育具有调节作用5。【本研究切入点】目前，烟碱生物合成途径大致清楚15-18，但对其生物合成的调节一直是攻克的难题。【拟解决的关键问题】本研究通过电子克隆和RT-PCR 从烟草根系中分离了NAC 类转录因子NtNAC-R1，并进行生物信息学分析。同时用pRESTB 原核表达系统进行该基因的原核表达，并研究了其组织特异性表达，以及打顶对N

14、tNAC-R1的表达所产生的影响，为揭示烟草NAC 类转录因子基因在烟草根系发育与烟碱生物合成之间的关系奠定基础。1 材料与方法1.1 植物材料试验材料为大田栽培烟草品种K326，在烟草打顶前（0 h），打顶后2、4、6、8、10和24 h分别取其根尖组织（04 cm）、茎和叶，置于液氮中，并保存于-80冰箱备用。 1.2 载体和主要试剂大肠杆菌DH5、BL21和原核表达载体pRSETB 由国家烟草栽培重点实验室代谢网络调控室保存。Trizol 试剂、M-MLV 反转录酶、pMD TM 19-T Vector、PGEM-4Z 载体、Bam H 、Kpn 、Sph 和Sac 限制性内切酶、蛋白质

15、marker 、T4 DNA连接酶等购自大连宝生物公司。DNA 凝胶回收试剂盒购自北京天根公司。Wizard Plus SV Mini Preps试剂盒购自Promega 公司。DIG RNA Labeling Kit购自Roche 公司。引物合成和测序由北京博尚生物技术有限公司完成。 1.3 烟草NtNAC-R1的克隆以国家烟草栽培重点实验室代谢网络调控室构建的烟草打顶前后SSH cDNA文库中筛选出的一条NAC 类转录因子EST 序列（HO059652）为查询探针，搜索烟草的EST 数据库进行BLAST 比对，找到部分重叠的EST 序列7条，将得到的7条EST 序列进行聚类分析，尽量避免含

16、有旁系同源基因，然后由CAP3软件进行拼接，将获得的序列重叠群作为新的查询探针，继续搜索烟草EST 数据库，直到没有新的EST 可供拼接为止，并将拼接得到的序列对非冗余数据库进行搜索，证明这是一个全新的序列。根据电子克隆得到的cDNA 序列在ORF 附近设计引物，NAC-R ：11期 戚元成等：烟草中NAC 类转录因子基因的克隆及分析 22275；NAC-F ：5AAGG-3（下划线处分别为Bam H 和Kpn 酶切位点）。分别以烟草根尖组织总RNA 的反转录产物cDNA 和基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增，反应条件为94 5 min ；94 30 s ，61 30 s ，72 1.5

17、min ，30个循环；72 10 min 。PCR 产物纯化回收后，连接至pMD TM 19-T Vector，转化大肠杆菌DH5，鉴定并测序。1.4 烟草NtNAC-R1的序列分析利用核苷酸数据库的BLAST 进行同源性比对分析；利用DNAStar 软件进行开放阅读框（open reading frame ，ORF ）的查询；应用ExPASy （http ：/www.expasy. ch/）提供的ProtParam 对氨基酸序列进行相对分子量、等电点（pI ）运算，并应用ScanProsite 程序分析烟草NtNAC 氨基酸序列功能结构域；用MEGA4.0软件绘制系统进化树。1.5 NtNA

18、C-R1在大肠杆菌中的诱导表达用Bam H 和Kpn 限制性内切酶对pMD TM 19-T 重组质粒双酶切，回收目的片段，同时双酶切原核表达载体pRSETB ，T4 DNA连接酶连接（16，过夜），而后转化大肠杆菌DH5，将阳性克隆转化大肠杆菌BL21，并进行鉴定。分别将连接有目的片段的菌株和空载体菌株接种于含0.1 mg·mL-1氨苄青霉素（Amp ）的LB 培养基中，37振荡过夜。以1100的比例转接于100 mL含有同样浓度抗生素的LB 液体培养基，37振荡培养至对数生长期（OD 600=0.61.0），加入终浓度为0.1 mmol·L-1的IPTG ，于低温25诱导

19、表达。分别取未诱导培养与诱导培养2和6 h的菌液1 mL ，离心，收集菌体，超声波裂解，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE 电泳，检测重组蛋白的表达情况。1.6 烟草NtNAC-R1的组织特异性表达分析采用Trizol 法提取烟草根、茎、叶的总RNA ，反转录cDNA 。利用Actin 作为内参来调整PCR 反应的模板量。PCR 引物及反应条件同1.3步骤。 1.7 烟株打顶后24 h 内根尖组织NtNAC-R1的表达分析采用Trizol 法提取打顶前和打顶后2、4、6、8、10和24 h烟草根尖组织总RNA ，RT-PCR 检测条件同1.3步骤。Northern 杂交：探针制备，根据

20、烟草NtNAC-R1序列设计1对特异性引物，NAC -S ：5-GGAGTAGCAT GCGAATTACCAGCGGGA-3；NAC -A ：5AGCTCTCCTTTTCACCGTGC-3（下划线处分别为Sph 和Sac 酶切位点）。以pMD TM 19-T 重组质粒为模板，PCR 扩增，回收目的片段。双酶切目的片段和PGEM-4Z 载体并回收，T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5，进行鉴定。取阳性单克隆菌10 µL于5 mL含有0.1 mg·mL-1 Amp 的LB 液体培养基中，37，200 r/min摇菌过夜，收集菌液，提取质粒，具体操作步骤按照Wizard P

21、lus SV Mini Preps试剂盒说明书进行。用Sph 将质粒线性化之后进行体外转录，反应体系为4 µL 5×buffer 、2.5 mmol·L-1dNTPs 、0.175 mmol·L-1 Dig-UTP、1 µg Template 、20 U RNase inhibitor、20 U SP6 RNA polymerase ，补DEPC H2O 至20 µL，混匀后37转录过夜。探针标记按DIG RNA Labeling Kit说明书进行。取各个时期根尖组织总RNA 2 µg，3.5% PAGE 电泳，采用Bio-

22、rad 半干转膜系统转至带正电的尼龙膜，杂交方法按DIG RNA Labeling Kit说明书进行。2 结果2.1 烟草NtNAC-R1的克隆与序列分析以烟株打顶前、后构建的SSH cDNA文库中筛选到的NAC 类转录因子EST 序列为查询探针，运用BLAST 程序搜索烟草的EST 数据库，对重叠的序列进行拼接，得到一条1 348 bp的cDNA 片段，有完整的开放性阅读框架（936 bp）、5端和3端分别有129 bp 和283 bp的非编码区（图1）。在开放阅读框附近设计1对特异性引物，以烟草根尖组织cDNA 为模板，从烟草根尖组织分离出一条长约1 000 bp的cDNA 片段（图2），

23、其序列与电子克隆的一致，具有完整的开放性阅读框架，编码311个氨基酸，将其命名为NtNAC-R1（HQ413134）。同时，以烟草基因组DNA 为模板进行扩增，也获得相同大小的特异性条带（图2），表明NtNAC-R1内部没有内含子。序列分析显示，该基因具有NAC 典型的保守结构域，富含R 、H 、K 碱性氨基酸（图1），相对分子质量为35 901.4，等电点为6.52。将NtNAC-R1的保守结构域序列与矮牵牛（AAM34766）、拟南芥、辣椒（AAW4809）、番茄（AAR88435）、（NP -171677）马铃薯（CAC42087）、玉米（ACG36788）、大豆（ACD39384）、柑

24、橘（ABQ96643）中的NAC 蛋白2228 中 国 农 业 科 学 44卷 下划线部分代表NtNAC-R1保守结构域；粗体表示富含的氨基酸Underline indicates conserved domain of NtNAC-R1; Bold indicates rich in amino acid图1 NtNAC-R1的核苷酸序列和预测的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of NtNAC-R1 保守结构域序列比对显示（图3），它们之间有高度同源性，且NtNAC-R1与茄科植物保守结构域的同源性均达到85%

25、。系统进化分析（图4）显示，NtNAC-R1蛋白的保守结构域与矮牵牛亲缘关系较近，与茄科植物聚类在一起。将TOBFAC 数据库19（http:/ /tobfac/）中烟草NAC 与NtNAC-R1进行系统进化分析（图5），NtNAC-R1与NAC67亲缘关系较近。M ：分子量标准DL2000；1：空白对照；2：基因组DNA 为模板的PCR ；3：cDNA 为模板的PCRM: DNA marker DL2000; 1: H2O; 2: Genomic DNA; 3: cDNA2.2 NtNAC-R1的原核表达经SDS-PAGE 电泳检测诱导

26、前后融合蛋白表达图谱（图6）显示，诱导后有一条相对分子量为40.4 kD的特异性条带，表明NtNAC-R1能够在原核生物中完整的表达，由于仅在沉淀中检测到特异条带，说明目的蛋白以包涵体形式表达。图2 NtNAC-R1 的PCR 扩增结果 Fig. 2 NtNAC-R1 amplified by PCR11期 戚元成等：烟草中NAC 类转录因子基因的克隆及分析 2229黑色背景表示完全一样的氨基酸序列 Black background indicates identical amino acid sequence图3 烟草NtNAC-R1与其它NAC 蛋白保守结构域的比对Fig. 3 Align

27、ments of NAC domain between NtNAC-R1 in Nicotiana tabacum and other NAC proteins 2.3 NtNAC-R1的组织特异性表达分析检测烟草根、茎和叶中的NtNAC-R1的表达谱（图7）显示，NtNAC-R1在烟草根、茎和叶中均表达，但在根中的表达水平显著高于其它组织。2.4 NtNAC-R1在烟株打顶后24h 内的表达谱分析对烟株打顶后24 h内NtNAC-R1的表达谱进行了连续检测，结果（图8）显示，烟株打顶后2 h和4 h相对不打顶的烟株，根系中NtNAC-R1的表达水平是图4 烟草NtNAC-R1与其它NAC 蛋

28、白的系统进化树分析 Fig. 4 The phylogenetic tree of NtNAC-R1 in Nicotianatabacum and other NAC proteins降低的，但打顶后6 h，NtNAC-R1表达水平较4 h显著提高，随后的8和10 h基本保持稳定，至24 h，NtNAC-R1表达水平达到打顶后4 h的4.5倍，是不打顶的1.6倍。Northern 杂交也显示了相似结果（图9）。2230 中 国 农 业 科 学 44 卷 Fig. 5 图 5 NtNAC-R1 与其它烟草 NAC 的系统进化树分析 Phylogenetic analysis of NtNAC-

29、R1 and other NAC genes in Nicotiana tabacum 3 讨论 NAC 类转录因子是植物中一种重要的调控因子， 其表达受植物发育时期及多种环境因素的诱导，对生 物和非生物胁迫产生应答。同时，NAC 类转录因子自 身的表达也处于复杂的调控网络之中，主要包括在转 录水平和翻译后水平对其表达进行调控，转录水平的 如拟南 表达调控主要是通过 microRNAs 起作用20-21。 芥中 miRl64 通过调节具有 NAC 功能域转录因子家 族，如 CUCl、CUC2、NAM、NAC1、At5907680 和 M：低分子量蛋白标准；1：阴性对照（pRSETB）；2：未诱

30、导重组子 （pRSETB-NtNAC-R1）裂解上清液；34：IPTG 诱导 2 h、6 h 后裂解 上清液； 5： 未诱导重组子 （pRSETB-NtNAC-R1） 裂解沉淀； 67： IPTG 诱导 2 h、6 h 后裂解沉淀 M: Low molecular weight marker; 1: Negative control (pRSETB; 2: Lysis supernatant of the strain BL21 (pRSETB-NtNAC-R1 without induction; 3-4: Lysis supernatant of the strain BL21 (pRSE

31、TB-NtNAC-R1 at 2 h and 6 h after induction with IPTG, respectively; 5: Lysis pellet of the strain BL21 (pRSETB-NtNAC-R1 without induction; 6-7: Lysis pellet of the strain BL21 (pRSETB-NtNAC-R1 at 2 h and 6 h after induction with IPTG, respectively At5961430 来调控植物分生组织的发育、顶端器官的 分化以及侧根的发育22。Laufs 等23在拟

32、南芥中过量 表达 miRl64， CUCl 和 CUC2 的表达量下降， 而 CUC3 不受影响。为探讨烟株打顶后根系烟碱合成能力显著 增强的机制，国家烟草栽培重点实验室代谢网络调控 室采用 SOLAX 测序得到烟株打顶前、后根尖组织 miRNA 谱，发现 miRNA164 在打顶后显著减少（打 顶前 10 054 reads， 打顶后 5 131 reads， 资料未发表） 。 同时，在构建的烟草打顶前后根尖组织 SSH cDNA 文 图 6 NtNAC-R1 在大肠杆菌中表达的 SDS-PAGE 分析 Fig. 6 SDS-PAGE analysis of NtNAC-R1 in E.co

33、li BL21 11 期 戚元成等：烟草中 NAC 类转录因子基因的克隆及分析 2231 A：RT-PCR 分析 NtNAC-R1 的组织特异性表达；B：NtNAC -R1 的组织特异性相对表达量 A: Tissue-specific analysis of NtNAC-R1 in Nicotiana tabacum by RT-PCR; B: The relative expression level of NtNAC-R1 in different tissues in Nicotiana tabacum 图7 Fig. 7 NtNAC-R1 的组织特异性分析 Tissue-specifi

34、c analysis of NtNAC-R1 in Nicotiana tabacum 1：不打顶烟株 Un-topped plants；27：打顶 2、4、6、8、10 和 24 h 烟株 Topped 2, 4, 6, 8, 10, and 24 h plants, respectively A：NtNAC-R1 在烟株打顶后 24 h 内的 RT-PCR 结果；B：NtNAC-R1 在烟株打顶后 24 h 内的相对表达量 A: The RT-PCR results of NtNAC-R1 expression during 24 h after tobacco topping; B: T

35、he relative expression level of NtNAC-R1 during 24 h after tobacco topping 图8 Fig. 8 RT-PCR 分析 NtNAC-R1 在烟株打顶后 24 h 表达水平变化 RT-PCR analysis of the changing expression level of NtNAC-R1 during 24 h after tobacco topping 1：不打顶烟株 Un-topped plants；27：打顶 2、4、6、8、10 和 24 h 烟株 Topped 2, 4, 6, 8, 10, and 24

36、h plants, respectively A：NtNAC-R1 在打顶后 24 h 内的 Northern 杂交分析；B：NtNAC-R1 在打顶后 24 h 内的相对表达量 A: Northern blotting analysis of the NtNACR1 expression during 24 h after tobacco topping; B: The relative expression level of NtNAC-R1 during 24 h after tobacco topping 图9 Fig. 9 Northern 杂交分析 NtNAC-R1 在烟株打顶后

37、24 h 表达水平变化 Northern blotting analysis of the changing expression level of NtNAC R1 during 24 h after tobacco topping 2232 中 国 农 业 科 学 44 卷 库中，也发现一条与 NAC 类转录因子基因有 86%同 源性的 EST 序列。 已知 miRNA164 的靶基因是 NAC1， NAC1 对植物根系生长发育具有调控作用。因此，采 用电子克隆结合 RT-PCR，从烟草根系中克隆了 NAC 转录因子基因，命名为 NtNAC-R1。经生物信息学分 析，具有典型的 NAC 保

38、守结构域，且具有表达活性。 这为进一步研究根系发育与烟碱合成能力之间的关系 奠定基础。 Rushton 等 24 试验基础。 4 结论 根据烟株打顶前后 miRNA 谱分析结合 SSH 文库 筛选出一条与矮牵牛 NAC 具有 86%同源性的 EST 序 列，从烟草根系中分离了 NAC 转录因子基因 NtNACR1。生物信息学分析该基因具有典型的 NAC 类转录 因子保守结构域， 属茄科植物特有， 并具有表达活性。 组织表达特异性分析表明该基因在根系中具有高水平 表达，但在烟株打顶后 24 h 表达水平显著降低，表 明该基因具有响应烟株打顶所导致的信号传递作用。 References 1 Aid

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45、 NAC 基因家 族分为 7 个亚家族，其中有 6 个亚家族在其它植物种 属中也存在，第七个亚家族只存在于茄科植物中，包 含了烟草中数目最多的 NAC 基因，被称为 TNACs。 笔者将 NtNAC-R1 保守结构域与茄科 （番茄、 马铃薯、 矮牵牛和辣椒）和非茄科植物（拟南芥、玉米、大豆 和柑橘）中的 NAC 保守结构域进行比对聚类分析， 发现 NtNAC-R1 属于典型的茄科植物 NAC 类转录因子 基因 （图 3， 图 4） ， 从 （http:/compsysbio.achs.virginia. edu/tobfac/）数据库中下载 80 多条烟草 NAC 基因进 行聚类， 发现 Nt

46、NAC-R1 与 Rushton 等 19 报道的 NAC67 亲缘关系最近。 目前还没有发现 NAC67 功能注释， 已 知很多次生代谢产物的生物合成是在根系进行的，这 为进一步研究其在根系发育中的功能及对次生代谢途 径的调节具有一定的意义。 NAC 在不同植物中的不同组织及不同发育阶段 表达强度是有差异的。如在花生成熟叶、幼叶、根、 荚果和未成熟种子中皆有 AhNAC2 和 AhNAC3 表达。 其中，AhNAC2 在幼叶、根、荚果和未成熟种子中的 表达量高，在成熟叶的表达较弱，AhNAC3 在叶片表 达量较高 25 。 Xie 等 发现在拟南芥中 NAC1 在根中表 5 达水平最高，在茎

47、和叶中表达水平相对较低。由于 NtNAC-R1 从烟草根系分离获得，为了解该基因在烟 草根系中的表达与其它组织中是否有差异，检测了 NtNAC-R1 在烟草根、茎、叶中的表达水平，发现 NtNAC-R1 在烟草根中的表达水平相对较高。同时为 进一步研究 NtNAC-R1 在烟草打顶前后根尖组织中的 动态变化，阐明根系响应烟株打顶所产生的生理效应 与 NtNAC-R1 之间的关系，笔者分析了打顶后 24 h 内 （每 2 h 检测一次）NtNAC-R1 的动态变化，发现在打 顶后 24 h 具有显著变化，这与 Shi 等 14 对烟株打顶 后根系中激素 IAA （indoleacetic aci

48、d ） 、 JA （jasmonic acid）含量显著变化的时间（120 min）是一致的，这 也为进一步研究烟株打顶后根系发育与烟碱生物合成 对 IAA 和 JA 的响应与 NAC 之间的关系提供了很好的 11 期 戚元成等：烟草中 NAC 类转录因子基因的克隆及分析 2233 expression of pathogenesis-relatedgenes in Arabidopsis. The Plant Journal, 2005, 43(5: 745-757. 9 Hegedus D, Yu M, Baldwin D, Gruber M, Sharpe A, Parkin I, Wh

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