人类体细胞染色体标本制备与核型分析

1、实验一 人类体细胞染色体标本制备与核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype【实验目的】1 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。2 熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。【实验原理】染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞

2、进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹带，表明每条染色体的特征。【实验用品】1采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。2RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（1

3、0mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。32.5胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。【实验步骤】一外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析1. 采血及接种培养1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。1.3 在超净工作台中，预先将RPMI 1640液体培养基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴全血（6号针头），

4、水平摇动混匀。1.4 置37恒温培养箱中培养72小时。培养过程中每天水平摇动培养物12次，使血液均匀悬浮，再继续培养。1.5 终止培养前24小时，加入秋水仙素，使终浓度达到0.2g/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养至72小时。2制片2.1 收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中。2.2 1000 rpm离心8分钟（注意先配平）。2.3 弃上清液，加入37预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37恒温水浴箱低渗处理25分钟。2.4 加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸

5、管小心吹打、混匀，1000rpm离心8分钟。2.5 弃上清液，加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。2.6 1000 rpm离心 8分钟。2.7 弃上清液，重复固定一次。2.8 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。2.9 吸取少量细胞悬液，滴23滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。2.10 将标本置Giemsa染液中，染色8分钟，水洗去浮色，气干。2.11 显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。二人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析1. G显带染色体标本制备1.1 常规制片后，将标本置70烤箱中干烤2小时，自然冷却

6、。1.2 取2.5胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45 ml生理盐水，用 1N HCl或1N NaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色（PH6.87.2），置 37OC预温。1.3 将玻片标本放入胰酶溶液中处理2545秒钟，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长。1.4 取出染色体玻片标本，置于37预温的生理盐水中，然后用蒸馏水冲洗玻片（或轻甩，除去多余的胰酶）。1.5 将玻片标本放入37预温的Giemsa染液中，染色510分钟。1.6 自来水冲洗，气干。1.7 显微镜观察。【实验结果与分析】一. 常规染色体核型分析1根据染色体的形态、大小及着丝

7、粒的位置，将染色体分为七组。A组染色体：包括13号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。B组染色体：包括45号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。C组染色体：包括612号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。D组染色体：包括1315号染色体，具有近端着丝粒和随体。E组染色体：包括1618号染色体，16号染色体着丝粒在 3/8处，17号和 18号染色体着丝粒约在 1/4处。F组染色体：包括19号和20号染色体，中央着丝粒。G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，为近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。

8、2绘图：绘出在显微镜下观察到的染色体。二G显带染色体标本分析G带显示的正常人显带核型特征（见附图1.1、1.2、1.3）A组染色体：包括13号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。1号染色体短臂：在320条带左右的分裂相上，近侧段有两条深带，第2条深带稍宽；在处理好的标本上，远侧段可显出34条浅染的深带。此臂分为3个区，近侧的第1深带为2区1带，第2深带为3区1带。长臂：副缢痕紧贴着丝粒，染色深浅不一，其远侧为一宽的浅带，近中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条染色较浓。此臂分为四个区，副缢痕远侧的浅带为2区1带，中段第2深带为3区1

9、带，远侧段第1深带为4区1带。2号染色体短臂可见四条深带，中段的两条深带较靠近。此臂分为2个区，中段两条深带之间的浅带为2区 1带。 长臂：有 7条深带，第 3和第4深带有时融合。此臂分为 3个区第2和第3深带之间的浅带为2区1带，第4和第5深带之间的浅带为3区1带。3号染色体着丝粒区浓染短臂：在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中远侧的一条较窄，且着色较浅，这是区别3号染色体短臂的重要特征。近侧段的深带可分为两条深带。此臂分2个区，中段浅带为2区1带。长臂：一般在近侧和远侧段各有一条较宽的深带。在显带好的标本上，近侧段的深带可分为两条深带，远侧段的深带可分为三条深带。此臂分为2

10、个区，中段浅带为2区1带。B组染色体：包括45号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。 4号染色体短臂：可见两条深带，近侧深带染色较浅，短臂只有一个区。长臂：可见均匀分布的四条深带，在显带较好的标本上，远侧段的两条深带可各自再分为两条较宽的深带。此臂分为3个区，近侧段第1和第2深带之间的浅带为2区1带，远侧段的两条深带之间的浅带为3区1带。5号染色体短臂：可见两条深带，其中远侧的深带宽而且色浓，短臂只有一个区。长臂：近侧段有两条深带，染色较浅，有时不明显；中段可见三条深带，染色较深，有时融合成一条宽的深带；远侧段可见二条深带，近末端的一条着色较浓。此臂可分为3个区，中段第 2深带

11、为 2区1带，中段深带与远侧段深带之间的宽阔的浅带为 3区 1带。C组染色体：包括612号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。 6号染色体短臂：中段有一条明显而宽阔的浅带，其中近侧段和远侧段各有一条深带，近侧深带紧贴着丝粒；在显带较好的标本上，远侧段的深带又可分为两条深带。此臂分为2个区，中段的明显而宽阔的浅带为2区1带。长臂：可见五条深带，其中近侧的一条紧贴着丝粒，远侧段末端的一条深带着色较浅。此臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1带。7号染色体着丝粒浓染。短臂：有三条深带，中段深带着色较淡，有时不明显；远侧深带着色浓宽，状如”瓶盖”。此臂分为2个区，远侧段的浅带为2区1带。

12、长臂：有三条明显的深带，远侧近末端的一条深带着色较淡，第2和第3深带稍接近。此臂分为3个区，近侧第1深带为2区二带，中段的第2深带为3区1带。8号染色体短臂：有两条深带，中段有一条较明显的浅带，这是与10号染色体相区分的主要特征。此臂分为2个区，中段的浅带为2区1带。长臂：可见三条分界不明显的深带，远侧段的深带着色较浓。此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。9号染色体着丝粒浓染。短臂：近侧段和中段各有一条带，在显带较好的标本上，中段可见两条窄的深带，此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。长臂：可见明显的两条深带，副缢痕一般不着色，在有些标本上显现出特有狭长的颈部区。此臂分为 3个区，近侧的一条

13、深带为2区 1带，远出的一条深带为3区二带。10号染色体着丝粒浓染。短臂：近出段和中段各有一条深带，在有些标本的中段可见两条深带，但与8号染色体短行比较，其深带的分界不够清晰。此臀只有一个区。长臂：可见明显的三条带，近侧的深带较明显，远侧的两条深带较靠近，这是与8号染色体相鉴别的主要特征。此管分为2个区，近侧段的一条深带为2区1带。11号染色体短臂：近中段可见两条靠的很近的较窄的深带在显带较差的标本上，只能看见一条宽带。此臂只有1个区。长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒远侧段可见一条明显的较宽的深带，这条深带与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带，这是与12号染色体相鉴别的一个明显特征；在显带较好的标

14、本上，远侧段的深带可分为两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，一般极难辨认，但它是一个分区的界标，在有些标本上近末端处还可见一条窄的淡色的深带。此臂分为2个区，上述远侧两条深带之间的浅带为2区1带。12号染色体短臂：中段可见一条深带。此臂只有1个区。长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒；中段有一条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带，但与11号染色体相比较这条浅带较窄，这是鉴别11号与12号染色体的一个主要特征；在显带好的标本上，中段较宽的深带可分为三条深带，其正中的一条着色较浓；在有些标本上，远侧段的近端还可见12条染色较淡的深带。此行分为2个区，中段正中的深带为2区1带。X染

15、色体其长度介于7号和8号染色体之间。短臂：中段有一条明显的深带，如竹节状。在有些标本上，远侧段还可见一条窄的、着色淡的深带。此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。长臂：可见45条深带，近中部的一条深带最明显。此臂分为2个区，近中段的深带2区1带。D组染色体：包括1315号染色体，具有近端着丝粒和随体。13号染色体着丝粒浓染。长臂：可见4条深带，第1和第4带较窄，染色较淡。第2和第3深带较宽，染色较浓，此臂分为3个区，第2深带为2区1带，第3深带为3区1带。14号染色体着丝粒浓染。长臂：近侧和远侧各有一条明显的深带，在处理好的标本上，中段尚可见一条较浅的深带。此臂分为3个区，近侧深带为2区1带，

16、远侧深带为3区1带。15号染色体着丝粒浓染。长臂：中段有一条明显的深带，染色较浓，有的标本上，近侧段可见l2条淡染的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1带。E组染色体：包括 1618号染色体，16号染色体着丝粒在 3/8处，17号和 18号染色体着丝粒约在 1/4处。16号染色体短臂：中段有一条深带，较好的标本上可见两条深带。此臂只有1个区。长臂：中段和远侧各有一条深带，有时远侧段的一条不明显，副缢痕着色浓。此臂分为2个区，中段深带为2区1带。 17号染色体短臂：有一条深带，紧贴着丝粒。此臂只有1个区。长臂：远侧段可见一条深带，这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。此臂分为2个区，这条明显而

17、宽的浅带为2区1带。 18号染色体短臂：有一条窄的深带。此臂只有1个区。长臂：近侧和远侧各有一条明显的深带。此臂分为2个区，两深带之间的浅带为2区1带。F组染色体：包括19号和20号染色体，中央着丝粒。19号染色体着丝粒及周围为深带，其余为浅带。短臂和长臂均只有1个区。 20号染色体着丝粒区浓染。短臂：有一条明显的深带。此臂只有1个区。长臂：在中段和远侧段可见12条染色较浅的深带，有时全为浅带。此管只有1个区。G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，具近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。21号染色体着丝粒区着色浅。与22号染色体相比较，其长度比22号短。其长

18、臂近侧有一明显而宽的深带。此臂分为2个区，其深带为2区1带。22号染色体着丝粒区染色浓。与21号染色体相比较，其长度比21号长；在长臂上可见两条深带，近侧的一条着色较浓而且紧贴着丝粒，近中段的一条着色浅，在有的标本上不显现。此臂只有1个区。 Y染色体长度变化较大，有时整个长臂被染色成深带。在染色较好的标本上，可见两条深带。此臂只有1个区。图1.1 G显带染色体核型图1.2 G显带染色体核型分析图1.3 正常男性G显带染色体模式图【注意的问题】1采血时不要加入太多的肝素，因为肝素含量过多时往往抑制淋巴细胞的转化。2培养过程中培养液逐渐变黄色，说明pH发生了较大变化，将不利于细胞生长，此时可加入适

19、量灭菌的1.4% NaHCO3溶液调整，或再加入23ml培养液的办法来校正。3培养失败的原因，一般有下述几种：培养瓶及器材洗涤不符合要求；配制溶液的双蒸水不符合要求；PHA和培养液的质量有问题，或培养液pH不符合要求；无菌操作不符合要求，发生污染；淋巴细胞对PHA反应降低，致分裂相太少。4标本质量不佳的原因：秋水仙素的处理不当，如秋水仙素的浓度不够或处理时间不足，结果分裂相太少；如浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难于进行分析；低渗处理不当，低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；如果低渗处理不够，则染色体分散不佳，难以进行计数分析；离心速度不合适，收集细胞时离心的速度太

20、低易丢失细胞，如果低渗后离心速度过高，往往使分裂相过早破裂，完整的分裂相减少；标本固定不充分，如固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，结果染色体模糊，或残留胞浆痕迹，使背景不清；玻片去污不彻底，冷冻不够，使细胞悬液不能均匀附着以致细胞大量丢失，或染色体分散不佳。5制备G显带染色体标本时，要严格控制胰酶消化时间，时间不足显不出带纹，时间过长，使染色体不规则或形成空泡状。附 录一、试剂及配制：1、 RPMI1640培养液RPMI1640 10.4g肝素 80mgPHA 182mg胎牛血清 100ml抗菌素 8万单位NaHCO3 2g双蒸水定容至1000ml。抽滤除菌，分装，-200C保存待用。2

21、、 低渗液（0.075Mol KCl）KCl 2.794 g三蒸水 500ml3、 固定液甲醇（AR）：冰醋酸（AR）=3：1 现用现配。4、 Giemsa染液贮存液 Giemsa 5g纯甘油（AR） 330ml甲醇 （AR） 33ml先将Giemsa粉剂溶于少量的甘油中，在研钵中充分研磨至无颗粒粘糊状，再将全部甘油加入，然后移至烧杯中，在5560OC温箱中放置2小时，冷却后加入甲醇，充分搅拌均匀，在室温放置23周后过滤除去絮状物，储存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。使用液磷酸缓冲液甲、乙各2.5ml，加45ml双蒸水，加Giemsa原液2.5ml。5、 2.5%胰蛋白酶原液 胰蛋白酶

22、粉剂 2.5g 生理盐水 100ml 6、 秋水仙素（10mg/ml，使用液100g/ml） 秋水仙素 1g 生理盐水 100ml 抽滤，4OC棕色瓶保存。7、 肝素（2500U/ml，使用浓度50U/ml）肝素钠 312.5 mg生理盐水 100ml 高压灭菌。8、 Hanks液（g/L）NaCl 8.00KCl 0.40CaCl2 0.14MgSO47H2O 0.20Na2HPO4 0.06KH2PO4 0.06NaHCO3 0.35葡萄糖 1.00酚红 0.02二、记录和检查回报表表1 染色体病病例检查分析记录送检材料： 检查目的： 送检时间：编 号： 送 检 者： 院 科 医生患者姓名

23、： 性 别： 年 龄：临床检查摘要于临床初步诊断：家系资料： 表2 染色体检查记录（记录内容：显微镜号、标本号、座标、核型与异常特点）123456789101112131415 161718192021222324252627282930313233343537373839404142434445464748485051525354555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899100表3 染色体畸变分析记录玻片号性别号座 标核 型畸变染色体特点照片编号讨 论：分

24、析结果： 分析者： 年 月 日表4 核型分析 1 2 3 4 5 A B 6 7 8 9 10 11 12 X C 13 14 15 16 17 18 D E 19 20 21 22 Y F G表5核型分析检查回报单姓 名性 别年 龄送检材料送检目的时 间编 号送检者院 科 医生临 床 初步 诊 断细 胞 遗传 学 检查 结 果（1）X染色质检查 Y染色质检查（2）核型分析（3）皮肤文理特征（4）家系分析诊 断 检查者 签字 年 月 日实验二X和Y染色质标本的制作与观察X and Y Chromatin Preparation and Observation【实验目的】熟悉X染色质和Y染色质的

25、形态特征及其检查方法【实验原理】正常女性核型为46，XX。在间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即X染色质，这是女性细胞中一条X染色体随机Lyon化失活形成的。这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。称为X染色体的剂量补偿（参考Lyon假说）。正常男性核型为46，XY。在男性间期细胞核中，可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点，就是Y染色质（Y小体），大小约0.250.3m。是Y染色体长臂特异性着色而形成。人的性别是由X和Y染色体决定的。需要对人的性别进行鉴定时，除进行染色体核型分析和临床生殖器官的检查外，还可

26、以通过细胞学方法，如检查期间体细胞（口腔上皮，皮肤，羊水和血细胞等）的核内染色质X和Y染色质来鉴定。【实验用品】显微镜、荧光显微镜、乙醇(无水乙醇,95,70、50)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1结晶紫，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦镜纸、盖玻片、载片、15ml刻度离心管、牙签、吸水纸、小镊子、碘酒、酒精棉球、采血针、3醋酸溶液、pH66.5缓冲液、0.5盐酸阿的平染液。（注：硫堇染液(工作液)，干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后过滤备用；醋酸钠缓冲液：醋酸钠·3H2O 9.7g，巴比妥钠14.7g，溶于500mL蒸馏水中；0.1 molL盐酸；按：

27、=40：28：32比例配成混合液，调pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。） 【实验步骤】一、X染色质的制备和观察（一）取材1. 让受检者用水漱洗口腔数次，以尽量除去口腔内细菌或其它杂物。2.用牙签钝头部或木质器具刮取口内侧面的口腔粘膜上皮，弃去第一次刮到的细胞。3. 同一部位连续刮取数次，将刮取物涮入装有生理盐水的离心管内。（二）标本的制作1. 将细胞悬液的离心管进行离心（1 500 rpm）10分钟，去上清液，留下细胞团。2. 加入新配制的固定液（3份甲醇1份冰醋酸）8mL，混匀呈悬液。固定30分钟。3. 离心（同上），去上清液，留下细胞团。4. 加入数滴（根据细胞多少而

28、增减）固定液，充分混匀呈悬液。5. 滴一滴悬液至预先置冰盒中的干净载玻片上，晾干。每份样本制片34张。（三）染色Klinger硫堇染色法1. 将玻片标本置入1mol/L HCl中，37条件下水解20分钟。2. 用蒸馏水充分冲洗、晾干。3. 硫堇染液中染色约15分钟。4. 蒸馏水冲洗、晾干。硫堇染色的优点是只有细胞核清晰着色，胞浆不着色，因此细胞核背景清晰，利于对位于核膜边缘的X染色质的辨认。结晶紫的染色法1. 固定后的玻片标本经过70、50酒精及蒸馏水（更换两次蒸馏水）各5分钟。2. 置入1结晶紫溶液中染色58分钟。大量制片时可用0.5结晶紫染液，染色1015分钟左右。3. 95酒精中分化（快

29、速地在酒精中沾58次）。4. 继续在无水乙醇中分化，间歇地用显微镜检查，直至标本中核结构的微细部分都很清楚为止（一般约1分钟）。5. 置入二甲苯中。更换2次二甲苯，每次3分钟，以使标本透明。6. 树胶封片。（四）观察1.先在低倍镜(10倍镜)下观察，可见视野中有许多单个或成堆的口腔上皮细胞。选择清楚而分散的细胞，移至视野中央，再换高倍镜仔细观察。口腔上皮细胞为多边形的扁平状，细胞中央有一被染成深兰色的圆形或椭圆形的细胞核。核周围均质部分为细胞质。细胞的外表为一很难与细胞质相区别的薄膜即细胞膜。2. 40倍或油镜下检查100个“可计数细胞”，并计数具有X染色质的细胞数。二、Y染色质的制片与观察（

30、一）制作标本1. 采血与涂片：男同学用碘酒，酒精棉球常规消毒食指或耳垂后，用采血针点刺食指或尖或耳垂，挤出23滴血于一干净的底玻片中央，用牙签将血滴涂成较厚的一层血膜，直径约1.5cm，晾干。2. 固定：加3的醋酸溶液数滴于血膜上，静置15分钟，其间可换液一次，使红细胞溶解。3. 用pH66.5磷酸缓冲液冲洗血膜，晾干。4. 染色：加0.5盐酸阿的平溶液数滴于血膜上，放置暗处静置染色15分钟。（若使用口服阿的平片剂，则用100mg溶于10ml双蒸水中，染色时间为25分钟）。5. 再用磷酸缓冲液冲洗黄色溶液。6. 加盖玻片，在有缓冲液的情况下，用荧光显微镜进行观察。（二）观察Y染色质 先在低倍镜

31、下观察，可见许多白细胞（多为淋巴细胞）核染成黄色。换高倍镜，可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点，就是Y染色质（Y小体），大小约0.250.3m。最后可用油镜再仔细观察。Y染色质在男性白细胞的出现率可达6070。注意需要计数的细胞必须是核膜完整无缺，核质染色均匀，清晰可见，核周围无细菌和其它污染物质的干扰。【实验结果与分析】观察并计算X染色质的阳性率。X染色质的标准是：1. 位于核膜内缘。2. 核内唯一的浓染、轮廓清楚的小体，直径约为11.5m,一般呈平凸形、圆形、扁平形或三角形。(注：配制的pH66.5的磷酸缓冲液要用黑纸或茶色瓶置于冰箱保存，有效期一个月。)实验三 姊妹染色单

32、体交换实验Sister Chromosome Exchange （SCE）【实验目的】熟悉制备SCE标本的原理和基本程序。【实验原理】姊妹染色单体交换（Sister chromatial exchange,SCE）是染色体同源座位上复制产物间的相互交换，是同一染色体的两条单体之间发生的一类特殊的同源重组，主要在DNA合成期形成，可能与DNA双链的断裂与复制有关，SCE的发生的频率可反映细胞在S期的受损程度。如果一个个体的SCE率明显增高，可表明染色体受到环境中的一定因素的影响，或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。在细胞分裂时，每条染色体均有两条染色单体组成，每条染色单体有一条双链DNA组成。5

33、-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy-uridine，BrdU）是脱氧胸腺嘧啶核苷的类似物，在DNA链的复制过程中，可替代胸腺嘧啶。当细胞生存环境中存在BrdU时，BrdU取代脱氧胸苷掺入到复制的DNA中。经两个复制周期后，两条姊妹染色单体中一条DNA的双链均有BrdU掺入，而另一条DNA双链中仅有一条链有BrdU掺入。利用特殊的分化染色技术对染色体标本进行处理，可使双链均含有BrdU掺入的单体浅染，而只有一条链掺入BrdU的单体深染。当姊妹染色体间存在同源片段交换时，可根据每条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。由于姐妹染色单体的DNA序列相同，SCE并不改变遗传物质组成，但SCE

34、是由于染色体发生断裂和重接而产生的，因此，SCE显示方法通常用来检测染色体断裂频率，用来研究药物和环境因素的致畸效应。【实验用品】1. 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、冰箱、离心机、显微镜、采血器材、酒精灯、培养瓶、刻度离心管、胶塞、乳头吸管、试管架、载玻片、托盘天平、干燥烤箱、染色缸、电吹风、30W紫外灯。2. 试剂：RPMI 1640培养液、小牛血清、秋水仙素（100g/mL）、5-溴尿嘧啶（BrdU，200g/mL）、低渗液（0.075 mol/L KCL溶液）、2×SSC、Giemsa原液、甲醇、冰乙酸。【实验步骤】1. 按半微量法采取外周静脉血，接种培养。2. 37培养

35、24小时后，加BrdU溶液（终浓度为8g/mL）混匀。3. 用黑纸包裹培养瓶，继续培养48小时。4. 收获前加入秋水仙素（终浓度为0.2g/mL），继续培养1小时。5. 常规法制片。将玻片标本室温放置23天。6. 分化染色前一天，将标本置37过夜。7. 在平皿中平行放置两根牙签，将玻片放在牙签上，加适量2×SSC溶液（以不超过标本为度）。在标本上盖一张比玻片稍大的擦镜纸，使纸边浸入2×SSC溶液中，并使2×SSC溶液渗至玻片标本上，保持标本湿润。8. 将平皿置55水浴面上，用30W紫外灯垂直照射标本30分钟，照射距离10cm。9. 照射后轻轻取掉擦镜纸，立即用蒸馏

36、水冲洗标本。10. Giemsa染色510分钟；蒸馏水冲洗标本，气干。11. 镜检，计数。每个末端交换记为1次SCE，中部交换记为2次SCE。【实验结果与分析】观察30个细胞的分裂相，记录每个细胞的SCE总数，计算SCE频率。n个中期分裂相SCE之和SCE频率= n个细胞中国人正常SCE频率为5.7±0.4。实验四银染核仁形成区与近端着丝粒染色体随体联合AgNO3 Staining NOR and Satellite Association of Acrocentric Chromosome【实验目的】熟悉银染的原理和方法。【实验原理】人类近端着丝粒染色体的副缢痕与核仁形成有关，故称

37、为核仁形成区（NOR）。当位于此处的18S、28S核糖体RNA的基因（rDNA）具有转录活性时，应用银染技术可使NOR特异性着色（褐黑色）。进一步证明银染物质不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成区特异的蛋白质，即和rRNA转录相联系的酸性蛋白。人类核糖体RNA基因位于5对近端着丝点染色体短臂的次猛痕处，即人类的核仁形成区。在正常人中， 不是所有核仁形成区均被银染，其范围大约4-10。应用银染法可以觉察正常人体核糖体RNA基因的活动。此外，人类近端着丝粒染色体的随体间易发生联合，应用银染技术可在发生联合的染色体间清楚地看到银染物质相连。因此，应用银染核仁形成区（Ag-NOR）与近端着丝粒

38、染色体随体联合（Ag-AA）技术，可以分析有活性的rRNA基因的动态变化。正常人Ag-NOR平均为5.8/细胞。【实验用品】1. 恒温水浴箱、显微镜、平皿、牙签、擦镜纸、镊子；2. 预制染色体玻片标本、0.1甲酸、AgNO3（50）。1：20 Giemsa,5mol/L HCl。【实验步骤】1. 按半微量法采取外周静脉血，接种培养。常规法制片。将染色体玻片标本在室温下放置23天。2. 将标本置入5mol/L HCl溶液中常温处理5分钟，蒸馏水冲洗2-3次，甩干。3将500mg AgNO3溶于1 ml 0.1甲酸溶液中，混匀后立即滴45（5ml）滴至玻片标本上。4. 在平皿中平行放置两根牙签，将

39、玻片标本放在牙签上。5. 在标本上盖一张比玻片稍小的擦镜纸，用镊子掀动纸片数次，使染液均匀分散在标本上。6. 将平皿置于60水浴箱中处理3-5分钟，直至擦镜纸呈棕黄色终止反应。7. 蒸馏水冲洗去擦镜纸，以1：20 Giemsa染液复染3分钟。水洗，气干。8. 镜下观察。【实验结果与分析】1. Ag-NOR的计数：选择银染着色清晰的分裂相，计数6个D组（13、14、和15号染色体）和4个G组（21和22号染色体）近端着丝粒染色体，不论单侧或双侧的银染点都计数为一个有银染的染色体。2. Ag-AA计数：凡近端着丝粒染色体之间有银染物质相连的，均计数为Ag-AA。涉及2条近端着丝粒染色体的联合，记为

40、1个Ag-AA；涉及3条近端着丝粒染色体的联合，如未形成闭环的，记为2个Ag-AA；3条染色体联合形成闭环时，记为3个Ag-AA；依此类推。N个核型中含NOR染色体数之和NOR均值= N个核型（注：避免AgNO3 溶液污染皮肤，否则将其染成褐黑色，很难洗掉。）实验五核酸提取The Extraction of Nucleic Acid【实验目的】1掌握核酸提取的基本原理和基本方法2掌握检测核酸浓度及纯度的原理及方法【实验原理】DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的

41、工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到：1、根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。核酸的提取关键是去除蛋白质，通常情况下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提，在单价阳离子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。作DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数。在260nm的读数用于计算样品中的核酸浓度，OD值为1相当于大约50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA及大约20g/ml单链寡核苷酸。根据

42、在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度。DNA及RNA纯品的OD260/OD280值分别是1.8和2.0，如果样品中污染有蛋白或酚，其OD260/OD280将明显低于此值，此时无法对样品中的核酸进行精确定量。【实验用品】1台式离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；紫外分光光度计；一次性塑料手套。2微量加样器（1000l,200l，20l）；Tip头（1000l,200l，20l）。Tip头盒（1000l,200l，20l）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。3DNA提取的相关试剂：1） 蛋白酶K（10mg/ml）,-20保存。2） TE（

43、pH 8.0）:10mmol/L Tris.Cl（pH 8.0）,1mmol/L EDTA（pH 8.0）,15磅高压灭菌后室温保存。3）10% SDS：10g SDS溶于90ml 水中，加热68助溶，加几滴浓盐酸调节pH至7.2，加蒸馏水定容至100ml，室温保存。4）3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。5）饱和氯化钠，70%乙醇，氯仿6）饱和酚【实验步骤】饱和氯化钠抽提法提取外周血DNA1取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混匀；2室温离心，10000rpm ，1分钟；3弃上清，加

44、入0.4ml TE(pH 8.0)， 混匀，悬浮细胞；4加入10mg/ml蛋白酶K 5l（终浓度100g/ml）,10% SDS 25l(终浓度0.5%)，混匀；537水浴消化过夜，或50消化4小时；6加入1/3体积的饱和氯化钠，充分混匀，4静置10分钟；710000rpm离心10分钟，取上清于另一新管中；8加入等体积氯仿，混匀，10000rpm离心10分钟；9取上清于另一新管中，加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2)混匀；10加入2倍体积无水乙醇轻轻混合，10000rpm离心1分钟；11弃上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗涤；1210000rpm离心1分钟，弃上清，自然干燥DN

45、A约5分钟；13加入200-250l TE，-20保存；14检测浓度及纯度。酚氯仿抽提法提取外周血DNA1外周血反复冻溶破坏红细胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混匀后，10000rpm 离心10分钟；2弃上清，加入180l TE(pH 8.0)，20l 10% SDS,10mg/ml蛋白酶K 5l（终浓度100g/ml）混匀；337水浴消化过夜，或50消化4小时；4加入等体积的饱和酚并充分混匀，10000rpm离心10分钟；5吸取上清液于另一新管中，重复上一步骤一次；6吸取上清液于另一新管中，加入等体积的酚氯仿并充分混匀，10000rpm离心10分钟；7吸取上清液于另一新管中，加

46、入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2) 混匀后，加入2倍体积无水乙醇并轻轻混合，可见絮状乳白色DNA团块，10000rpm离心10分钟；8弃上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗涤；9. 10000rpm离心1分钟，弃上清，自然凉干后加入TE液，-20保存；10检测浓度及纯度组织总RNA的提取 1. 将组织用锡箔纸包裹后于液氮中冻10min，击碎后回收入2ml无菌Eppendorff管中。按50-100mg组织样品加1ml TRIZOL试剂进行组织匀浆,样品体积不应超过TRIZOL试剂体积的10%；2.将组织匀浆液在15-30放置5min,促使核蛋白复合物完全解离,按1ml TRIZO

47、L,加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15s,15-30放置2-3min,在2-8,离心转速不超过12000g,离心15min,将上清液转入新的离心管中(上清液约占TRIZOL试剂体积的60%)；3. 在上清液中按1mlTRIZOL试剂(最初匀浆体积)加入0.5ml异丙醇混匀,15-30放置10min,在2-8,离心转速不超过12000g,离心10min；4.弃上清,70%乙醇洗涤RNA沉淀 (1ml TRIZOL试剂至少加入1ml 70%乙醇),振荡混匀,在2-8,离心转速不超过7500g,离心5min；5.室温或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55-60温浴10min).6.紫外分光光

48、度计检测RNA浓度和纯度；7.1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA，每孔上样25g，65V，2.5h，以检测RNA的质量。【实验结果分析】1. 计算已提取的DNA的浓度和纯度【思考题】1DNA提取还有哪些方法？2RNA提取中关键问题是什么？实验六 DNA重组技术Recombinant DNA【实验目的】1掌握DNA重组技术的基本原理和基本方法2熟悉质粒DNA的小量制备及酶切鉴定方法【实验原理】1DNA重组技术 重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤：1） 重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA

49、或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。2） 将重组DNA分子转化宿主细胞。3） 克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，

50、得到大量含重组DNA的细菌。4） 收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。图2.1 TA克隆原理示意图图2.2 克隆选择增殖原理示意图2质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.012.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心，将

51、可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。3质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：、型。型切点不固定，型其切割位点在识别位点之外，只有型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均为型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的线状DNA（DNA分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的DNA分子进行初步鉴定。【实验用品】1PCR扩增仪；恒温振荡培养箱；超净工作台；细菌恒温培养箱；台式高速离心