生物化学与分子生物学：14_DNA的生物合成

1、Chapter 14 DNA Biosynthesis， Replication学习目的：学习目的：1. 理解理解DNA复制的基本特征。复制的基本特征。2. 理解理解DNA复制的酶学。复制的酶学。3. 理解理解DNA复制的基本过程复制的基本过程。DNA是由四种脱氧核糖核苷酸所组成的长链大分是由四种脱氧核糖核苷酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物的遗传信息就贮子，是遗传信息的携带者。生物的遗传信息就贮存在存在DNA的四种脱氧核糖核苷酸的排列顺序中。的四种脱氧核糖核苷酸的排列顺序中。DNA通过通过复制复制将遗传信息由亲代传递给子代；通将遗传信息由亲代传递给子代；通过过转录转录和和翻译翻译

2、，将遗传信息传递给蛋白质分子，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的遗传学的中心法则中心法则。 在在RNA病毒中，其遗传信息贮存在病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给反转录将遗传信息传递给DNA，再由，再由DNA通过转通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就录和翻译传递给蛋白质，这种遗

3、传信息的流向就称为称为反中心法则反中心法则。DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDPDNA复制（复制（DDDP）转录（转录（DDRP）RNA蛋白质蛋白质翻译翻译RNA复制（复制（RDRP）反转录（反转录（RDDP）Section 1 The Basic Features of DNA ReplicationDNA在复制时，以亲代在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合的每一股作模板

4、，合成完全相同的两个双链子代成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代，每个子代DNA中都含有一股亲代中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为链，这种现象称为DNA的的半保留复制半保留复制。 一、一、DNA以半保留方式进行复制以半保留方式进行复制DNA Is Replicated by Semi-conservative Pattern 重要概念：重要概念：semi-conservative replication可能的可能的DNA复制方式复制方式DNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在1958年由年由M. Meselson 和和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该所完成的

5、实验所证明。该实验步骤为：实验步骤为：Step I 将大肠杆菌在含将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约的培养基中培养约十五代，使其十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为中的碱基氮均转变为15N。Step II 将大肠杆菌移至只含将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同的培养基中同步培养一代、二代、三代。步培养一代、二代、三代。Step III 分别提取分别提取DNA，作密度梯度离心，将，作密度梯度离心，将具有不同密度的具有不同密度的DNA分离开。分离开。DNA半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明DNA半保留复制研究实验步骤半保留复制研究实验步骤DNA半保留复制研究实验结果示意图半保留复制研究实验

6、结果示意图按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的信息，体现了遗传的保守性保守性。遗传的保守性是物种稳定性的分子基础，但遗传的保守性是物种稳定性的分子基础，但不不是绝对的是绝对的。半保留复制的意义半保留复制的意义DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点复制起始点(origin) 。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真在原核生物中，复制起始点通常为

7、一个，而在真核生物中则为多个。核生物中则为多个。二、二、DNA复制从起始点向两个方向延伸复制从起始点向两个方向延伸The Chain Elongation is from the Origin to Two Different Directions in the Process of DNA Replication细菌和酵母菌中细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列复制起始点的碱基序列习惯上把两个相邻习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离复制起始点之间的距离（或（或DNA片段）定为一个片段）定为一个复制子（复制子（replicon） 。复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制

8、的功能单位。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为这种叉状结构称为复制叉（复制叉（replication fork）。53oriorioriori535533553复制子复制子3复制起始点与复制子示意图复制起始点与复制子示意图复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）DNA replication with two forksDNA复制时，以复制起始点复制时，以复制起始点(origin)为中心，向两个方为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，

9、称为双向复制（双向复制（bidirectional replication）。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。双向复制与单向复制双向复制与单向复制参与参与DNA复制的复制的DNA聚合酶，必须以一段具有聚合酶，必须以一段具有3-端自由羟基（端自由羟基（3-OH）的）的RNA作为作为引物引物(primer) ，才能开始聚合子代才能开始聚合子代DNA链。链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为引物的大小，在原核生物中通常为50100个个核苷酸，而在真核生物中约为核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其

10、模板引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。的碱基顺序相配对。 三、三、DNA复制反应呈半不连续性复制反应呈半不连续性The Reaction of DNA Replication Exhibits Semi-discontinuous ReplicationDNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方向聚合方向聚合子代子代DNA链链，即即模板模板DNA链链的方向必须是的方向必须是35。由于由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。链时，子代链的聚合方向也是

11、不同的。3 5 3 5 3 5 3 5 解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)DNA的半不连续复制的半不连续复制3 5 以以35方向的亲代方向的亲代DNA链作模板的子代链链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为聚合方向为53 ，这一条链被称为，这一条链被称为领头链领头链（leading strand）。以以53方向的亲代方向的亲代DNA链为模板的子代链链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是是53，这条链被称为，这

12、条链被称为后随链（随从链，后随链（随从链，lagging strand）。由于亲代由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，双链在复制时是逐步解开的，因此，后随链的合成也是一段一段的。后随链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，在复制时，由后随链所形成的一些子代由后随链所形成的一些子代DNA短链称为短链称为冈崎片冈崎片段段。冈崎片段的大小，在原核生物中约为冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。个核苷酸。 重要概念：重要概念：Okazaki fragmentSection 2 Enzymology and To

13、pology for DNA ReplicationDNA复制时，在聚合酶的催化下，以四种脱氧核复制时，在聚合酶的催化下，以四种脱氧核糖核苷酸为糖核苷酸为底物（原料）底物（原料），即，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP，脱水缩合生成，脱水缩合生成3,5-磷酸二酯键而磷酸二酯键而连接成多核苷酸链。连接成多核苷酸链。一、复制的基本化学反应是核苷酸之间脱水缩合一、复制的基本化学反应是核苷酸之间脱水缩合The Basic Chemical Reaction of Replication is the Dehydrated Condensation Between Nucleotides(dNMP

14、)n + dNTP (dNMP)n+1 +PPiDNA复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应DNA的复制还是模板依赖性的，必须要以亲代的复制还是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。链作为模板。亲代亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。行复制。 二、二、DNADNA聚合酶催化脱氧核苷酸之间的聚合聚合酶催化脱氧核苷酸之间的聚合The Polymerizing Reactions Between Deoxynucleotides Are Catalyzed by DNA Polymerase全称：全称：依赖依赖DNA的

15、的DNA聚合酶聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP )简称：简称：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合酶活性的聚合酶活性 2. 53 或或3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 DNA聚合酶的核酸外切酶活性聚合酶

16、的核酸外切酶活性在原核生物中发现的在原核生物中发现的DNA聚合酶至少有三种，聚合酶至少有三种，分别命名为分别命名为DNA聚合酶聚合酶（pol ），DNA聚聚合酶合酶（pol ），DNA聚合酶聚合酶（pol ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与参与DNA复制的主要是复制的主要是pol 和和pol 。（一）原核生物至少有三种（一）原核生物至少有三种DNA聚合酶聚合酶pol 为具有三种酶活性为具有三种酶活性的单一肽链的大分子蛋的单一肽链的大分子蛋白质，可被特异的蛋白白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两种中的

17、大片段保留了两种酶活性酶活性,即即53聚合酶聚合酶和和35外切酶外切酶活性，通常活性，通常被称为被称为Klenow fragment。 Klenow片段的分子结构片段的分子结构pol 由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中：其中：a a亚基亚基具有具有53聚合聚合DNA的酶活性，参与的酶活性，参与DNA复复制；制；e e亚基亚基具有具有35 外切酶的活性，与复制校正有关；外切酶的活性，与复制校正有关；b b亚基亚基具有具有DNA滑动钳夹作用，与亲代滑动钳夹作用，与亲代DNA链的结链的结合有关（在真核生物中，则是以合有关（在真核生物中，则是以增殖细胞核抗原增

18、殖细胞核抗原PCNA作为钳夹蛋白）。作为钳夹蛋白）。原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶的结构的结构聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶钳夹加载蛋白钳夹加载蛋白滑动钳夹滑动钳夹3-5 外切酶外切酶 原核生物中的三种原核生物中的三种DNA聚合酶聚合酶 在真核生物中发现的在真核生物中发现的DNA聚合酶主要有五种聚合酶主要有五种:DNA-pol a a 起始引发。起始引发。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。DNA-pol b b在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol 参与参与DNA损伤修复，

19、可能有填补缺口损伤修复，可能有填补缺口的作用。的作用。DNA-pol e e（二）真核生物（二）真核生物DNA聚合酶主要有五种聚合酶主要有五种真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶为了保证遗传的稳定，为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保的复制必须具有高保真性。真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：复制时的保真性主要与下列因素有关：1.遵守严格的碱基配对规律遵守严格的碱基配对规律；2.DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3.对复制过程中出现的错误及时进行校正对复制过程中出现的错误及时进行校正。 三、三、DNADNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制

20、的保真性聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性The Verification and Base-selection of DNA Polymerase Contribute to the Fidelity of Replication（一）复制的保真性依赖于正确的碱基选择（一）复制的保真性依赖于正确的碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成，即只有当碱与共价（磷酸二酯键）键的有序形成，即只有当碱基之间完成正确的氢键形成后，才会催化磷酸二酯基之间完成正确的氢键形成后，才会催化磷酸二酯键的连接。键的连接。嘌呤的

21、化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 嘌呤化学结构的顺式和反式构型嘌呤化学结构的顺式和反式构型（二）核酸外切酶活性在复制中辨认并切除错配碱基（二）核酸外切酶活性在复制中辨认并切除错配碱基A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切酶活性。不表现外切酶活性。解旋酶（解旋酶（helicase） ，又称解链酶、又称解链酶、Dn

22、aB蛋白蛋白或或rep蛋白，是用于解开蛋白，是用于解开DNA双链的酶。双链的酶。每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2分子分子ATP。（一）解旋酶、引物酶和引发体（一）解旋酶、引物酶和引发体四、复制时解链伴有四、复制时解链伴有DNADNA分子拓扑学的变化分子拓扑学的变化The relaxation of double strand DNA is followed by the topological changes in replication引物酶（引物酶（primerase）本质上是一种本质上是一种依赖依赖DNA的的RNA聚合酶（聚合酶（DDRP），该酶以，该酶以DNA为模板，为模

23、板，聚合一段聚合一段RNA短链引物，以提供自由的短链引物，以提供自由的3-OH，使子代使子代DNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。引物酶需组装成引物酶需组装成引发体引发体才能催化才能催化RNA引物的合引物的合成。成。在在E. coli中，含有中，含有解旋酶解旋酶（DnaB蛋白）蛋白） 、DnaC蛋白蛋白、引物酶引物酶（DnaG蛋白）和蛋白）和DNA复制起始区复制起始区域域的复合结构被称为的复合结构被称为引发体（引发体（primosome） 。DNA复制起始时的解链则是复制起始时的解链则是DnaA（辨认复制起始（辨认复制起始点）、点）、DnaB和和DnaC三种蛋白共同作用的结果。三种蛋白共同作用

24、的结果。 Dna A Dna B Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶含有解螺旋酶(DnaB蛋白蛋白)、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶(DnaG蛋白蛋白)和和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 引发体的组装形成引发体的组装形成3 HO53 5 3 5 引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白（single strand DNA binding protein, SSB），又称螺旋反稳蛋白又称螺旋反稳蛋白(HDP)，在真，在真核生物中通常称

25、为核生物中通常称为复制蛋白复制蛋白A（RPA），是一些能，是一些能够与单链够与单链DNA结合的蛋白质因子。结合的蛋白质因子。（二）单链（二）单链DNADNA结合蛋白结合蛋白Single-strand DNA Binding Protein (SSB)SSB的生理作用的生理作用1. 使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，单链能够稳定存在，即即稳定单链稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代，便于其作为模板复制子代DNA；2. 保护单链保护单链DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。（三）（三）DNADNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNADNA超螺旋状态超螺旋状态人类拓扑异

26、构酶人类拓扑异构酶的分子结构的分子结构DNA拓扑异构酶是一类能够松解拓扑异构酶是一类能够松解DNA超螺旋超螺旋结构的酶。结构的酶。1010 8 8 局部解链后局部解链后DNA复制过程中正超螺旋的形成复制过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶的作用特点拓扑异构酶的作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶的拓扑异构酶的分类分类拓扑异拓扑异构酶构酶u切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松

27、弛状态变为松弛状态。u反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶u切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。u利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）可催化两段可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。五、五、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口连接酶连接复制中产生的单链缺口The G

28、ap of Single Strands Produced in Replication is Sealed by DNA LigaseDNA连接酶连接酶ATPADP+PiHO5POO-O-O353POO-O-O3553DNA连接酶的连接作用连接酶的连接作用DNA连接酶连接酶催化的条件催化的条件是：是： 需一段需一段DNA片段具有片段具有3-OH，而另一段而另一段DNA片段具有片段具有5-Pi基基； 未封闭的未封闭的缺口位于双链缺口位于双链DNA中中，即其中有，即其中有一条链是完整的；一条链是完整的； 需要消耗能量，需要消耗能量，由由ATP供能供能。1. DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作

29、用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。2. 在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。3. 是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。一。DNA连接酶的作用连接酶的作用Section 3 The Process of Prokaryotic DNA Replication1. 由由DnaA蛋白识别复制起始点（蛋白识别复制起始点（oriC）。）。2. 由拓扑异构酶和解链酶作用，使由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链链DNA（需（需DnaA、B

30、、C蛋白的协同作用）。蛋白的协同作用）。3. 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单）四聚体结合在两条单链链DNA上，形成上，形成复制叉复制叉。（一）（一）DNA的解链的解链一、复制的起始一、复制的起始Initiation of DNA Replication（二）引发体组装和引物合成（二）引发体组装和引物合成1. 由解旋酶（由解旋酶（DnaB蛋白）蛋白） 、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和蛋白）和DNA复制起始区域形成复制起始区域形成引发体引发体；2. 在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短为模板，合成一段短的的RNA片段（片

31、段（RNA引物引物），从而获得），从而获得3-端自由端自由羟基（羟基（3-OH）。）。 二、复制的延长二、复制的延长Elongation of DNA Replication复制的延长指在复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以35方向方向的亲代的亲代DNA链为模板，从链为模板，从53方向聚合子代方向聚合子代DNA链。链。复制延长的化学本质是复制延长的化学本质是dNTP以以dNMP的方式逐个的方式逐个加入引物或延长中的子链上，并催化磷酸二酯键加入引物或延长中的子链上，并催化磷酸二酯键不断生成。不断生成。 在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNA复制延长的是复制延长的是DNA聚合聚

32、合酶酶。 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-polDNA复制的延长过程复制的延长过程领头链的合成过程领头链的合成过程后随链的合成过程后随链的合成过程DNA聚合酶聚合酶催化领头链和后随链同时合成催化领头链和后随链同时合成DNA聚合酶聚合酶催化领头链和后随链同时合成催化领头链和后随链同时合成三、复制的终止三、复制的终止Termination of DNA Replication在复制过程中形成的在复制过程中形成的RNA引物，需由引物，需由RNA酶酶来来水解去除；水解去除；RNA引物水解后遗留的空缺，由引物水解后遗留的空缺，由DNA聚合酶聚合酶

33、催化延长空缺处的催化延长空缺处的DNA，直到剩下最后一个磷，直到剩下最后一个磷酸酯键的断口。酸酯键的断口。（一）去除引物，填补空缺（一）去除引物，填补空缺在在DNA连接酶连接酶的催化下，生成断口最后一个磷的催化下，生成断口最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。长链。 （二）封闭断口，连接冈崎片段（二）封闭断口，连接冈崎片段5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 后随链上不连续性片段的连接后随链上不连续性片段的连接Section 4 The Process of

34、 Eukaryotic DNA Replication一、真核生物复制的起始与原核生物类似一、真核生物复制的起始与原核生物类似The Initiation in Eukaryotic Replication Is Similar to that in Prokaryotes基本过程包括：解旋解链，形成复制叉；组装引基本过程包括：解旋解链，形成复制叉；组装引发体，合成发体，合成RNA-DNA引物。引物。主要区别：主要区别：1. 复制起始点更多，序列更短；复制起始点更多，序列更短；2. 复制有时序性，分组激活；复制有时序性，分组激活；3. 参与的酶和蛋白因子更多；参与的酶和蛋白因子更多；4. 复制

35、的起始与细胞周期的调控相关联。复制的起始与细胞周期的调控相关联。真核生物真核生物DNA复制起始需要：复制起始需要：1. DNA聚合酶聚合酶a a 与引物酶构成复合体，催与引物酶构成复合体，催化化RNA-DNA引物合成，起始引发；引物合成，起始引发；2. DNA聚合酶聚合酶 具有解螺旋酶和具有解螺旋酶和DNA聚合聚合酶活性，参与复制起始，并且是子代链延长酶活性，参与复制起始，并且是子代链延长时主要的复制酶；时主要的复制酶；3. DNA拓扑异构酶和复制因子（拓扑异构酶和复制因子（RFA、RFC等）；等）；4. 增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA） 可滑动的可滑动的DNA链钳夹。链钳夹。二、真

36、核生物复制的延长发生二、真核生物复制的延长发生DNADNA聚合酶的频繁转换聚合酶的频繁转换DNA Polymerases could be Exchanged Frequently in the Elongation of Eukaryotic Replication在真核生物在真核生物DNA复制的延长阶段，在引物酶复制的延长阶段，在引物酶-DNA聚合酶聚合酶a a复合体复合体催化合成的催化合成的RNA-DNA杂合引杂合引物物的基础上，由的基础上，由DNA聚合酶聚合酶 取代取代DNA聚合酶聚合酶a a催催化化领头链的连续合成，或领头链的连续合成，或催化后随链催化后随链的不连续合的不连续合成。成

37、。真核生物真核生物DNA的复制装置的复制装置由于真核生物由于真核生物DNA存在较多的复制子，故领存在较多的复制子，故领头链和后随链都比较短。头链和后随链都比较短。领头链通常为半个复制子的长度（双向复领头链通常为半个复制子的长度（双向复制），而后随链则大致与一个核小体单位的制），而后随链则大致与一个核小体单位的长度相当。长度相当。因此，延长阶段存在因此，延长阶段存在DNA聚合酶聚合酶a a和和DNA聚聚合酶合酶 之间之间的频繁转换。的频繁转换。1. 去除引物，填补空缺，连接片段去除引物，填补空缺，连接片段真核生物真核生物DNA复复制终止时，首先由制终止时，首先由RNase H和内切核酸酶和内切核

38、酸酶FEN1水解去水解去除除RNA-DNA引物；由引物；由DNA聚合酶聚合酶e e催化催化填补空缺；再填补空缺；再由由DNA连接酶连接酶催化连接冈崎片段。催化连接冈崎片段。2. 核小体组装核小体组装DNA复制完成后，组蛋白八聚体立即复制完成后，组蛋白八聚体立即与与DNA重新组装形成核小体。重新组装形成核小体。3. 重建端粒重建端粒线状线状DNA复制完成后，复制完成后，3-末端由于末端由于RNA引物被水解而形成空缺，需进行填补，即完成端粒的重引物被水解而形成空缺，需进行填补，即完成端粒的重建。建。三、真核生物复制的终止需组装核小体和重建端粒三、真核生物复制的终止需组装核小体和重建端粒Re-ass

39、embly of Nucleosome and Reconstruction of Telomere Are Needed in Termination of Eukaryotic Replication端粒（端粒（telomere）是是指真核生物染色体线指真核生物染色体线性性DNA分子末端的结分子末端的结构部分，通常膨大成构部分，通常膨大成粒状。粒状。功能功能维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性保证保证DNA复制的完整性复制的完整性端粒的结构特点端粒的结构特点由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱碱基的短序

40、列。基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG线性线性DNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。的催化下，进行延长反应。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒酶（端粒酶（telomerase）端粒酶是一种端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可蛋白质复合体，它可以其以其RNA为模板，通为模板，通过逆转录过程对末端过逆转录过程对末端DNA链进行延长。链进行延长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA

41、, hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶的组成端粒酶的组成端粒酶的作用机制端粒酶的作用机制爬行模型爬行模型端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）四、真核生物染色体四、真核生物染色体DNADNA在每个细胞周期只能复制一次在每个细胞周期只能复制一次Only One Time of Replication Happens in Each Cell Cycle for

42、Eukaryotic Chromosome DNA为了保证子代细胞中染色体为了保证子代细胞中染色体DNA的数目不会发生改的数目不会发生改变，真核生物染色体变，真核生物染色体DNA在每一细胞周期中只能被在每一细胞周期中只能被复制一次。复制一次。DNA的复制开始于复制起始点，这是一种能的复制开始于复制起始点，这是一种能自主复自主复制的序列（制的序列（ARS），散在分布于整个染色体，散在分布于整个染色体DNA分分子中。子中。在整个细胞周期中，复制起始点上结合有在整个细胞周期中，复制起始点上结合有起始识别起始识别复合物（复合物（ORC），其作用是提供一个与其他调节因，其作用是提供一个与其他调节因子结合的停泊