分子诊断学整理江大京江版

1、原核生物基因组原核生物主要包括、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等有关质粒按质粒的功能分类：致育质粒 F质粒）编码性菌毛，介导细菌之间的接合传递；耐药性质粒 R质粒） 编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性；毒力质粒 Vi质粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子；细菌素质粒 编码细菌产生细菌素；代谢质粒 编码产生相关的代谢酶。按复制机制分类：1、严紧控制型拷贝数少，一般10个，分子量大；调节因子是蛋白质，复制受限，受染色体DNA复制系统的控制；严谨控制机理（低拷贝原因），认为是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑制自身DNA合成。2、松弛控制型拷贝数多，10-200个，分子量小；调

2、节因子是RNA，复制不受染色体DNA复制系统限制基因工程使用松弛型（高拷贝数） 质粒，以获得较多的基因产物。性质：1、转移性：可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。2、质粒具有选择性标记：质粒有抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属盐基因等多种选择性标记；3、质粒的不相容性：同一类群的不同质粒一般不能在同一菌株内稳定共存；4、自主复制性：能独立于宿主染色体DNA外独立复制（但也必须在宿主细胞内才能复制）；质粒已成为分子克隆的有用工具，是目的

3、DNA的载体。载体质粒大多是在天然质粒基础上经人工构建而成，质粒的一些特点：1、有限制性核酸内切酶单一切口，可用以重组外源DNA；2、有筛选标记，如抗药基因等；3、插入外源DNA后，仍能转化宿主细胞，并能复制。质粒基因转移的方式： 1、接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用2、转化作用 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用3、转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导

4、作用4、转染作用 通过感染方式将外来 DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染 (transfection) 。转染是转化的一种特殊形式。病毒基因组完整的病毒颗粒包括：衣壳 、基因组（DNA或RNA） 、被膜、病毒颗粒中的其他内容物病毒分段基因组：流感病毒属分段RNA病毒意义：a）降低包装压力b）降低了造成断裂的可能性，提高编码能力c) 有分段基因组的病毒一般感染效率较低，只有全部基因组核酸片段存在时，病毒才具有感染能力。植物病毒d) 由于分段基因组易发生重组，故病毒容易变异。病毒基因组特点：1、5的帽子和3的poly（A）尾结构2、末端重复序列结果：粘性末段、正/反向互

5、补序列、长末端重复序列；3、 高效基因组：排列紧密很少间隔区，不仅非编码序列少，而且有重叠基因的存在；4、分段基因组：易重组，是病毒易变异的原因。真核生物基因组染色体的包装：（1）染色体的一级结构核小体（2）染色体的二级结构螺线管（3）染色体的三级结构超螺线管（4）染色体的四级结构染色单体真核生物染色体基因组一般特征1、真核生物的基因组比较庞大；2、线性双链DNA和二倍体；3、真核细胞基因转录产物为单顺反子。4、存在重复序列，重复次数可达百万次 以上5、基因是不连续的（断裂基因）重复序列：指多拷贝的相同或近似序列的DNA片段一、高度重复序列 ，按其结构特点分为三种 ：1、反向重复序列2、卫星D

6、NA 由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA 分开，因而称为卫星DNA （或随体DNA）3、较复杂的重复单位组成的重复顺序二、中度重复顺序 ：依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为：短散布元件和长散布元件Alu 家族：是哺乳动物基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族（短分散元件），Alu家族每个成员的长度约300bp ，每个单位长度中有一个限制性内切酶Alu的切点（AGCT），Alu可将其切成长130和170bp的两段，因而定名为Alu序列（或Alu家族）线粒体DNA的遗传特性 ： 母系遗传、突变率高、异质性、阈值效应、半自助复制与协同效应阈值效应：mtD

7、NA突变导致氧化磷酸化水平降低，当突变的mtDNA达到一定比例时，使得线粒体总的能量供应降低到维持组织正常功能所需能量的最低值时，才可能引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状。DNA分子多态性的主要方式 ：微卫星DNA多态性（同一位点不同个体之间有不同长度的微卫星DNA,STR）、单个核苷酸的变异单核苷酸多态性（SNP）等1、 微卫星 DNA 又称短串联重复STR，指以16个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列。微卫星DNA结构 序列由中间的核心区（重复序列）和外围的侧翼区（非重复序列）组成，其核心序列为16bp，为高度重复序列。 成因：1.姊妹染色单体的不均等交换 2.复制滑移2、SNP是

8、基因组中散在的单个核苷酸的变异形成的一种DNA分子多态性位置：编码区SNP cSNP） 、基因周边区SNP pSNP ）、 基因间SNP iSNP ）SNP非编码区 ： SNP编码区 = 5：1成因：单个核苷酸（碱基）置换： 转换 ：嘧啶嘧啶， 嘌呤嘌呤 ；颠换： 嘧啶嘌呤,嘌呤嘧啶 转换：颠换=3：1。对这三种类型生物基因组一些简单的比较病毒基因组：（1）病毒基因组小，结构简单。（2）不同病毒基因组可以是不同结构的核酸。（3）基因组相关基因常从即排列呈现转录单元。（4）病毒基因组的编码序列大于90%。（5）基因有连续和间断的。（6）有基因重叠现象原核生物基因组：（1） 基因组通常由一条环状D

9、NA分子组成。（2）基因组中只有1个复制起始点。（3）基因操纵子结构。（4）编码序列一般不重叠。（5）基因是连续的，无内含 子，转录后不需要剪切。（6）编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组，但小于病毒基因组。非编码区主要是一些调控序列。（7）基因组中很少有重复 序列。（8）细菌基因组中存在有可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。（9）具有编码同工酶的基因。（10）在DNA分子中具有多种功能的识别区 域。真核生物基因组:(1)每一种真核生物都有一定的染色体数目。（2）基因组远远大于原核生物基因组，具有许多复制起始 点。（3）真核基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反

10、子。（4）真核生物含有大量重复序列。（5）真核生物基因组内非编码序列占 90%以上。（6）真核基因是断裂基因。（7）功能相关的基因构成各种基因家族。（8）真核生物基因组中叶存在有一些可移动的遗传因素。蛋白质组蛋白质组：生物体的全套蛋白质；或一个生命单位的全套蛋白质特性：与基因组相比，蛋白质组有高度动态性：有组织特异性、生长发育特异性、生理病理状态特异性。研究的必要性：1、蛋白质的数量比基因的数量多（转录、翻译、翻译后水平的调控）2、基因组是静态的，蛋白质组是动态的3、蛋白质之间及其与其它各种大、小分子之间的广泛作用形成的犹如网络状的复杂系统。蛋白质组学 是研究生物体全套蛋白质的组成、结构与功能

11、的科学蛋白质的分离： 双向凝胶电泳及图像分析技术1、双向凝胶电泳第一向的固相pH梯度等电聚焦电泳IPG-IEF；第二向SDS-PAGE组成的分离系统 ：电泳速度只与蛋白质分子质量有关。原理：等电聚焦电泳:基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离； 聚丙烯酰胺凝胶电泳:是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离质谱：化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质荷比大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱。质谱技术MS：（用于蛋白质的鉴定）是在高真空系统中样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比差异，以确定样品相对分子质量及分子结构的技术。质谱仪的组成：离子源、质量分析器、检测

12、器核酸分离与纯化核酸分离提取的原则1、选择原则，一是保证提取核酸一级结构的完整性，二是尽量排除其他分子的污染2、保持核酸结构的完整性，应尽量减少破坏核酸的有害因素，尽量简化操作步骤。技术路线的设计1、核酸的释放，有物理法和化学法，化学法又分为溶胞法（应用最多最广泛）与干燥法2、核酸的分离纯化，须去除三方面的杂质：非核酸大分子物质，不需要的核酸分子，分离纯化过程中新加入的有机溶剂和金属离子等。3、核酸的浓缩、沉淀和洗涤浓缩：若溶液中DNA含量低且容积较大，不易进行乙醇沉淀时，可用固体聚乙二醇吸水浓缩法或丁醇抽提浓缩法浓缩DNA。沉淀与洗涤：有机溶液沉淀核酸主要是利用核酸可与纳钾等阳离子形成盐，屏

13、蔽了带负电的磷酸基团，使核酸分子聚集在一起而不溶于有机溶剂；盐类可使核酸沉淀，但往往含有少量共沉淀的盐，此时可经70-75%的乙醇洗涤而除去。核酸的鉴定首先是含量的鉴定1、 紫外分光光度法：核酸分子中的碱基对波长260nm的紫外光有强烈吸收作用（最大吸收峰），1微克DNA钠盐的吸光度之为0.02，也就是A260=1时 双链DNA含量为50g/ml，单链DNA/RNA含量为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml。适用于浓度大于0.25g/ml的核 酸溶液。2、荧光光度法，以荧光染料嵌入碱基平面，则核酸在紫外线的激发下发出荧光，且荧光强度积分与核酸含量成正比，有三个特点：灵敏度高；受RNA

14、，ssDNA和其他物质的干扰小；对分子生物学中的常用酶无抑制作用。其次是纯度鉴定1、紫外分光光度法：最常用，核酸在260nm处有最大吸收峰，蛋白质则在280nm处；盐和小分子在230nm处，酚在270nm处，这个差别可区分到底是什么污染；纯DNA的A260/A280=1.8，若高出说明RNA污染，若低于则说明残余蛋白质；A260/A280=2.0为高质量RNA的标志（1.8-2.1都可以） A230/A260=0.4-0.5，若升高则说明有残余盐。2、荧光光度法利用荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，核酸在紫外线的激发下发出橙红色荧光，作为荧光染料示踪。可鉴定DNA制品有无RNA干扰，反之亦可。R

15、NA变性电泳后有特征性的三条带，原核生物为23S、16S、5S的rRNA条带，真核生物则由28S、18S的rRNA和5S、5.8S的rRNA和tRNA；（mRNA代表基因转录水平，行使模版功能）还有完整鉴定性：以溴化乙锭为示踪染料的核酸琼脂糖凝胶电泳结果可用于判断核酸完整性1、完整无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特征性三条带外，三条带的荧光强度应为一特定比值2、降解系数大的核酸条带相对分子质量大，电泳迁移率低，溴化乙锭嵌入核酸中的数量也增多，荧光强度高；反之3、一般28S或23SRNA的荧光强度约为18S或16S的2倍，否则提示有RNA降解，若在加样槽附近有条带，则DNA有污染。保存：D

16、NA：原则是减少DNA脱氨基，抑制DNA酶、减少DNA分子的各种反应、避免微生物污染一般将DNA保存于pH8.0的TE缓冲溶液中，可减少DNA脱氨/抑制DNA酶，加少量氯仿可抑制细菌污染；在零下70度可保存5年+RNA：主要是抑制RNA酶以焦炭酸二乙酯水溶解RNA，或在RNA溶液中加入RNasin（RNA酶阻抑蛋白）等RNA酶抑制剂，可延长保存时间；另外将RNA以沉淀形式保存于70%乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液中，可于零下20度长期保存。分离纯化基因组DNA一般技术路线（含方法）(一)酚抽提法一些试剂的作用：EDTA：二价金属离子螯合剂，可螯合激活DNA酶必须的钙镁等离子，从而抑制DNA酶的活性

17、，还可降低细胞膜稳定性。SDS：阴离子除垢剂，可降解细胞膜，乳化脂质和蛋白质，使与其结合的物质沉淀而分离（还可使蛋白质变性、解聚和降解DNA酶）RNA酶顾名思义；蛋白酶K：水解各种蛋白质并裂解细胞；酚：强蛋白变性剂，使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性；pH8.0的Tris溶液（TE溶液）：使DNA顺利进入水相，避免其滞留于蛋白质层。（二）甲酰胺解聚法与酚抽提法类似，不同之处在于它是用高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物，然后以透析法除去蛋白酶和有机溶剂。（三）玻棒缠绕法本法以盐酸胍裂解细胞，基因组DNA沉淀于细胞裂解液和乙醇液的交界面，用带钩玻棒将沉淀的DNA缠绕于上，使高相对分子质量的D

18、NA沉淀从乙醇中转移出来，然后以pH8.0的Tris溶液重溶。回收DNA片段原则与要求：一是提高回收率，二是去除样品中的杂质重组DNA技术分子克隆（也称基因克隆或DNA克隆）：指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体DNA重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。 又称重组DNA技术。一、制备目的基因的方法：直接分离、人工合成、构建基因组文库G-文库、构建cDNA文库C-文库;二、载体的选择与构建载体：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。 载体化学本质为DNA分子 。要求：自主复制能力（重组D

19、NA能在受体细胞内复制）；具有多克隆酶切位点；具有易检测的遗传标记，便于筛选；相对分子质量小，在受体细胞内多拷贝，便于提取纯化；克隆载体：能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体表达载体：能够携带目的DNA片段进入宿主细胞扩增和表达，获得目的DNA蛋白质产物的一类DNA分子。对该类载体，还要求它能配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、加尾信号、增强子等DNA调控元件。三、连接DNA片段（目的基因&载体）的方法粘端连接（最好）、平端连接（无方向性）、定向连接（需要双酶切）、同聚物加尾连接、人工接头连接四、重组体DNA导入受体细胞的方法1、CaCl2转化法（实验必做

20、、必考）；2、电穿孔法；3、 磷酸钙共沉淀法；4、噬菌体的转染；5、脂质体法；6、显微注射法五、重组子的筛选原理：通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的重组子的过程重组体的筛选方法：1、根据遗传表型筛选（抗生素抗性筛选、B-半乳糖苷酶系统筛选）2、根据重组子结构特征筛选（1、快速裂解菌落并鉴定分子大小2、内切酶酶切图谱鉴定）3、核酸分子杂交筛选4、PCR筛选重组子5、核苷酸序列测定六、外源基因的表达与分离纯化（一）在原核细胞中表达目的：使外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速/高效合成基因产物，以大肠埃希菌表达系统的应用最为广泛。主要过程：DNA转录生成mRNA，后者再翻

21、译成蛋白质；条件：外源基因无内含子；具有强启动子、SD序列和翻译起始位点；连接后必须形成正确阅读框架；外源基因mRNA必须相对稳定，能有效翻译；形成的蛋白质不易降解。（二）在真核细胞中表达要求：除了和原核表达系统类似的以外，还需要启动子元件、增强元件、加poly（A）信号、剪切信号及其用于复制和选择的元件。分类：酵母表达系统（最理想）；哺乳动物表达系统。（三）外源基因表达产物的分离纯化。一些概念转化：以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转化。 转染：是指以噬菌体DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转染。感染：具有感染力的噬菌体将头部重组子导入受体细胞的过程

22、称为感染.重组子：含有重组DNA分子的转化细胞重组体：不同来源的DNA通过重组作用所组成的DNA分子重组DNA：不同来源的DNA通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程G-文库;将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落C-文库:将某种生物体基因组转录的全部mRNA,经反转录产生cDNA片段,再分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中。基因组文库：含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群II型限制酶：能够识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切

23、酶。识别序列特点：具有回文结构的DNA片段切割方式：在对称轴处同时切割DNA的两条链、在对称轴两侧相类似的位置切割两条链末端类型：平末端和3*或5*突出的粘性末端。DNA连接酶：是一种封闭DNA链上切口的酶催化反应的化学本质：修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键DNA连接酶的反应条件Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5MgCl2 10mmol/LATP 0.5-1mmol/LDTT 5mmol/LVolume 10-20LTemperature 4-15Time 4-16h作用：能够催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子形成磷酸二酯键，实现DNA重组。连接多个平头双链DNA

24、分子DNA聚合酶酶类与活性：1、大肠杆菌DNA聚合酶：参与DNA修复, 具53 核酸聚合酶活性、 35和53外切酶活性2、 T4 DNA聚合酶 ：有35的核酸外切酶活性、53的DNA聚合酶活性。3、逆转录酶： 以单链RNA为模板， 催化合成cDNA单链； 从5*末端或3*末端降解DNA杂合链中的DNA； 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。4、Taq DNA聚合酶 ：有强的53 DNA聚合酶活性、有5 3核酸外切酶活性、无3 5 核酸外切酶活性5、末端脱氧核苷酸转移酶：标记DNA的3OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。6、大肠埃希菌DNA聚合酶1

25、Klenow大片段，活性同37、5*-3*聚合酶活性、3*-5*外切酶活性26工具酶 作用限制酶： 识别和切割双链DNA连接酶： 连接两个DNA分子/片段聚合酶 I： DNA聚合、外切耐热DNA聚合酶 PCRTaqDNA聚合酶 聚合外切逆转录酶 cDNA合成碱性磷酸酶 切除末端磷酸基T4多核苷酸激酶 5*末端磷酸化末端转移酶 3*末端加入同质多聚物尾核酸酶S1，绿豆核酸酶 水解单链核酸，使双链DNA突出端变为平末端几种常用载体比较克隆容量 受体细胞 筛选原理质粒载体2Kb 大肠杆菌 pUC系列蓝白斑筛选 pBR322双抗生素筛选噬菌体载体 大肠杆菌 入噬菌体22Kb蓝白斑筛选 M13噬菌体1K

26、b蓝白斑筛选粘粒载体 40-50Kb 大肠杆菌 病毒载体 动物细胞酵母人工染色体200-1000Kb 酵母细胞pBR322质粒特点：1、相对分子质量好，4.363kb2、有一个复制起始点，为松弛复制子3、可用氯霉素扩增其质粒拷贝数4、有四环素、氨苄霉素两个抗药性基因5、有24种限制酶的单一识别点pUC：pUC18/19质粒载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA克隆载体。pUC是系列质粒载体结构特点：1） pUC载体较小，全长仅2686 bp；具有更高的拷贝数2）只保留了一个药物抗性基因Ampr3）大肠杆菌半乳糖苷酶基因的启动子及其编码-肽链的DNA序列LacZ 基因；4

27、）有一个多克隆位点区，极有利于克隆外源基因。分子克隆的基本步骤分：目的基因的获得（基因文库、逆转录、人工合成、从基因组分离）、载体的获得切：限制酶切割目的基因和载体，产生平末端或相同的粘性末端；接：连接酶连接分子间的粘性末端或平末端；转：重组体导入受体细胞，转化或转染；筛：双抗生简述筛选pUC载体和目的基因形成的重组体（1）2.69kb，保留了pBR322质粒的Ampr，转化菌可在氨苄青霉素培养基中存活；（2）LacZ基因 编码-半乳糖苷酶的一个片段，与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补成为完整的酶，催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物，菌落呈蓝色；（3）LacZ基因中有MCS 外源基因插入

28、，使LacZ基因插入失活，不能表达a-片段， 不能与宿主细胞互补，X-gal不能转变为蓝色，表现白色菌落。PCRPCR聚合酶链反应原理：由人为提供模板DNA、DNA引物、4种dNTP和DNA聚合酶，在体外条件下实现DNA复制的过程。用途：目的基因克隆、基因体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定、基因突变分析三个基本步骤：变性退火延伸变性：93-98摄氏度；退火：37-65摄 ；延伸：70-75摄，整个PCR过程一般需进行三十轮的循环,变性：在第一轮循环前需预变性，在94下变性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解链；（Tm值：DNA热变性发生在一个很窄的温度范围内，将DNA

29、变性达到50%时的温度称解链温度或溶解温度。GC越高，Tm值越高）退火：引物退火的温度的高低和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5退火温度越高, 所得产物的特异性越高（退火温度由引物的Tm值决定，延伸温度和时间由TaqDNA酶活性决定一般变性温度与时间为94 3050s产物由引物决定，循环次数由初始模版浓度决定）延伸：反应通常为72，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75标准的PCR反应体系模板DNA 0.12 ug引物 各0.11.0 umol/L4种dNTP混合物 各200 umol/LTaq D

30、NA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5-2.0 mmol/L产物不同原因：引物结合的模版不同1、长片段产物 以算术倍数增加 在终产物中忽略不计2、短片段产物：长度严格定格在两引物5*端之间，是需要扩增的特异片段 以指数倍数增加以上是PCR产物不需纯化的原因引物：实际上就是两段与待扩增靶DNA序列3侧互补的寡核苷酸片段。 扩增时从引物的3端开始，以5 3方向延伸，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置，两引物间距离决定扩增片段的长度。引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，其设计有3 条基本原则：1、引物与模板的序列要紧密互补；2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3

31、、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)基本要求：1.序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列，这样可减少非特异结合。2.引物长度以18-38nt为宜，多为20-24。3.ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不应超过3个连续的G或C。4.G+C占50-60% ：G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。5.两引物间要有匹配的GC含量和相似的退火温度。6.引物内部避免有互补序列形成二级结构。7.引物3端为关键碱基,其第1，2个碱基要严格配对，否则PCR失败或扩增效率和特异性降低。8.5-端无严格限制，其碱基可不与模板DNA互补而

32、呈游离状态，因此可在其外设计附加序列（如引入限制性内切酶位点，便于对扩增产物的分析和克隆），最多可加10个碱 基而对PCR反应无影响。PCR扩增产物的检测方法：、凝胶电泳：主要有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳最常用最经典，可判断产物大小、限制性内切酶酶切分析RFLP若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制性内切酶消化PCR产物，再进行电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可判定PCR产物的特异性及是否存在突变。 用于检测基因突变。RFLP限制性内切酶酶切分析：由于基因突变导致某一限制性内切酶的酶切位点序列产生或消失，经电泳分离出大小不同的片段。

33、、分子杂交：为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段或产物是否有突变、点杂交Southern印迹杂交 点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。用于检测基因突变，常规的southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性。、酶检测PCR法：比电泳检测灵敏度高，比分子杂交法简便。 首 先对PCR反应的引物5端进行修饰，一个引物的5端携带便于PCR产物固定的功能基因，如生物素等，另一个引物的5端具有便于酶联显色检测的基团， 如酶或抗原、抗体等。通过包被于微孔板中的基团如亲和素，将PCR产物固定于微孔板上，进行酶联显色，比色测定 适用于检测引物5端修饰的PCR产物 、测序 PC

34、R产物直接进行测序分析可检测基因突变 是检测其特异性的最可靠方法提高PCR的特异性和敏感性1、热启动PCR：一种在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪，通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。2、梯度PCR：复性温度高低决定扩增的特异性产物高低 选定一个复性温度范围，跨越引物Tm值1020。早期循环，复性时从高温开始，逐渐降低复性温度，直至最低复性温度3、巢式PCR （nested PCR）嵌套式PCR：用2对引物进行2次PCR来扩增目的基因 第一次PCR：一对外侧引物 第二次PCR：一对内侧引物4、免疫PCR：酶检测PCR法 通过免疫酶反应PCR来进一步提高敏

35、感性和特异性其他：多重PCR：它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同不对称PCR ：目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板、制备杂交探针、基因组DNA结构功能的研究反向PCR：目的：在于扩增一段已知序列旁侧未知DNA序列任意引物PCR：AP-PCR区分不同种的菌株、种内不同血清型、血清型内不同亚型。作用：判断相同种的不同分离株是否有流行病学上的相关性重组PCR

36、 ：利用PCR技术，使两个不相邻的DNA片段重组在一起的方法，称重组PCR目的：使2个不同来源的DNA片段重组； 构建基因突变体如点突变、缺失、插入等。反转录PCR (RT-PCR)：以RNA分子为模板进行的扩增，其首先要进行反转录产生cDNA，然后进行常规的PCR反应 关键步骤是RNA反转录为cDNA，由cDNA进行PCR与一般PCR无差别。荧光定量PCR（FQ-PCR）又称实时PCR(RT-PCR):非探针类PCR，通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并精确地计算出PCR的初始模板量其在HBV检测中的应用：HBV感染的早期诊断、监测治疗效果、判断病情，指导制定合理的治疗

37、方案、在乙肝病毒耐药性检测中的应用、血液制品和鲜血员的筛选，隐匿性肝炎的发现、HBV-DNA定量有助于指导怀孕，降低宫内感染的发生率、筛选肝炎的质量药物。核酸分子杂交技术核酸变性：在理化因素作用下，维系DNA二级结构的氢键和碱基堆积力遭到破坏，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变。核酸复性：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。核酸杂交的原理及步骤、结果分析一般步骤:1.提取组织、细胞的DNA。2.限制酶消化 DNA片段。3.电泳分离这些片段。4.转移至尼龙膜等支持物上。5. 与液相中标记的核酸探

38、针进行杂交。6.洗膜、放射自显影。结果分析：在与探针有同源序列的固相DNA的位置上将显示出杂交信号。分子杂交：不同来源的核酸变性后，合并在一起，只要这些核酸分子含有可以形成碱基互补配对的序列，复性也会发生在不同来源的核酸链之间，形成杂化双链。分 子杂交技术：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结 合核酸序列的位置或大小显示出来的技术。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的DNA、RNA。影响杂交的因素首先是核酸分子本身：1.核酸分子的大小：分子越大，扩散速度越

39、慢，单链分子间发现互补序列的几率就越小，复性速度越慢。2.核酸浓度：越大，复性速度越快。因为互补链相互碰撞的机会越大。3.核酸序列的复杂性序列越简单，越容易相互识别，复性就越快。反之，序列越复杂，复性就越慢。其次是外在因素：1.温度：DNA/DNA杂交：适宜温度为Tm -（20-25），与寡核苷酸探针杂交：适宜温度为Tm -5。2.离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加，高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定。3.甲酰胺：甲酰胺能降低核酸的Tm值和杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定。4.非特异性杂交反应：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附。探针的种

40、类和优缺点1.基因组DNA探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。真核基因组含有内含子序列；因此，其用于检测基因表达时，杂交效率低。2.cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后纯化作为探针使用。是目前应用最为广泛的一种探针。3.RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。4.寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针，极其方便。寡核苷酸探针的特点及设计原则特点：（1）根据需要

41、来合成相应的核酸序列，避免了天然探针的缺点；（2）大多数寡核苷酸探针长度较短,一般为1050bp,其序列复杂度低，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短；（3）寡核苷酸探针尤其适合点突变的检测(短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值)；（4）探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱。探针设计原则:（1）探针长度：一般要求在1050bp;（2）GC含量为4060;（3）探针分子中应避免互补序列;（4）避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个;（5）探针与非靶基因序列的同源性不能超过70或8个以上连续的碱基同源。理想的探针标记物应具备的特性？1、灵敏度高2、标记物与探针结合后，应不影响杂

42、交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值3、标记物对检测方法无干扰4、检测方法要灵敏、特异、稳定、简便5、标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。如何增强组织的通透性和核酸探针的穿透性？组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体，影响探针的穿透和杂交体的形成；去垢剂和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质； 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落探针的标记法1.全段标记之缺口平移法： 原理：用DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口，切口处形成3-OH末端。大肠杆菌DNA聚合酶I从切口处开始作用，以另一条DNA链为模板,以 dNTPs为原料，在水解核苷酸的同时沿切口进行修复，标记的核

43、苷酸便随之参入新链中，故称：切口平行推移。利用大肠杆菌DNA聚合酶I同时具有的 53核酸外切酶活性和53聚合酶活性，将预先用同位素或非同位素修饰的dNTP掺入到新合成的DNA探针中去。2.全段标记之随机引物法： 随即引物是人工合成的、含有各种可能排列顺序的六核苷酸片段（46）的混合物。可以与任何核酸片段杂交，以此作为聚合酶反应的引物。将这些引物与变性的 DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。3.聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就

44、在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。4.RNA探针的标记：RNA聚合酶体外转录法制备，一边合成一边标记。5.寡核苷酸链探针的标记：可以通过在寡核苷酸合成时加入特定标记的核苷酸来实现，也可以通过DNA探针的末端标记法对其3或5末端进行标记。6.末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。Southern印迹杂交的基本步骤？Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。基本步骤：1、基因组DNA经限制酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳2、将含有DNA片段的凝胶放入变性溶液使DNA变性3、将固体支持物放在凝胶上，通过毛细管虹吸或电转移将脚上的DNA片段转移到固体支持物上

45、，转移过程中，各DNA片段间的相对位置保持不变，然后通过加热使DNA固定于膜上4、加入探针使之与膜上的DNA杂交5、冲洗掉为杂交的探针，检测杂交信号毛细管虹吸印迹法其基本原理容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上原位杂交：以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法原位杂交时组织和细胞的理想固定液应具备哪些条件？1、保持组织细胞的形态2、对核酸无抽提，修饰与降解作用3、不改变核酸在组织细胞内

46、的定位4、不阻碍核酸与探针的杂交过程5、对杂交信号无遮蔽作用6、理化性质稳定荧光原位杂交（FISH）定义：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。通过荧光标记的探针，与待测标本的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别与计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织标本进行检测和诊断。该法能提供较快速且分辨率较高的评估。标本：中期染色体（最多），间期核，伸展染色质纤维，完整细胞/组织切片。临床诊断常用的探针：着丝粒探针（针对染色体着丝粒区域重复DNA序列，适合分析染色体的数量异常）染色体涂抹探针（简称为涂抹探针，可识别一条特定染色体全长的单一序列，从而将一条完整的染色体染

47、色而得以显示，故名。可检测中期细胞染色体，以确定/鉴别染色体数目/结构的异常。）基因座特异探针（是与染色体某一特定基因的单拷贝DNA序列杂交的探针。当已经分离至一个基因的一小段时，可用它检测该基因位于哪条染色体）端粒重复序列探针（每条真核细胞染色体的末端称为端粒，都具有相同的非编码重复序列 n*TTAGGG，以该重复序列构成的探针称为端粒重复序列，可与细胞中所有染色体末端杂交 ）应用：先天性疾病；肿瘤；病原体 的检测核酸测序技术Sanger双脱氧链终止法定义：以靶DNA链为模板，指导核酸合成的过程中，以释放荧光为检测信号，从而对靶DNA链进行实时测序的方法原 理：利用DNA聚合酶，以单链DNA

48、为模板，以dNTP为底物，在四组相对独立的反应体系中分别加入不同的ddNTP作为链反应终止剂，根据碱基配对原 则，在测序引物引导下，合成四组有序梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识度待测DNA的序列【在 DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上，致链延伸反应终止。在模板指导和测序引物引导下，按碱基配对原则，聚合酶不断将 dNTPs加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链。如果加入ddNTPs,由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个OH，故不能与 后续的dNTP形成磷酸二酯键，最后每个反应体系中可合成一系列

49、具有相同的5端和不同3端的引物延伸链的长短不一的混合物。各反应体系的系列产物的 3末端分别是其相应的核苷酸。通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（可区分一个核苷酸之差）分离和放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按53方 向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。】如何来确定模板DNA的量？当固定C循 环数后，荧光信号与模板数成正比；当固定t荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数 越多，Ct值越小利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始模板拷贝数的对数，纵坐标代Ct值只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线

50、上计算出该样品的起始拷贝数。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析荧光域值：是指 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号。DNA测序策略一、已知序列：确证性测序，是对已知的核酸序列进行鉴定和证实二、未知序列确定一个未知DNA序列的准确长度及核苷酸排序1、随机测序法：包括鸟枪法和人工转座子法，该类方法无方向性，随机对靶DNA进行测序，通过计算机拼装而得到完整信息。2、定向测序法主要有嵌套缺失法和引物步入法，该类方法有方向性，从待测DNA某一端开始按顺序进行测序，直至将DNA的序列测完。生物芯片技术生物芯片分类：基因芯片、 蛋

51、白质芯片、 芯片实验室基 因芯片的技术原理：是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺 入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得 出所要的信息。基因芯片制备流程：探针的制备：原位合成 、合成点样 生物芯片的制作、样品处理、杂交或反应、杂交检测及数据处理等缩微芯片实验室：将生命科学领域中许多不连续的分析过程，如样品制备、核酸标记、生化反应、分离检测、数据处理等，通过采用半导体光刻加工等缩微技术，集成到一块生物芯片所形成的一种便携式生物化学分析系统应用篇遗传性疾病的分子诊断策略和方法遗传性疾病分两类：符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病、不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（又称多因素性疾病）策略：直接诊断、基因多态性连锁分析、定量诊断遗传病的分子诊断：1、血红蛋白病：血红蛋白病可以分为由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异常血红蛋白病； 由于珠蛋白多