蛋白酶产生菌的筛选及固态发酵生产优质蛋白原料的研究

1、河南农业大学硕士学位论文蛋白酶产生菌的筛选及固态发酵生产优质蛋白原料的研究姓名：王朋朋申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：尹清强20100601河南农业大学硕二：论文摘要蛋白质饲料资源的不足已成为世界性问题，在我国尤其严重。随着畜牧业的高速发展，常规蛋白饲料已经远远不能满足畜牧业发展的需要，开发新的饲料蛋白资源成为我国饲料业的重要课题。采用微生物固态发酵非常规蛋白饲料生产优质蛋白饲料是国内外研究的主要方向。本研究试图从牛瘤胃中分离筛选出高产以蛋白酶为主并产多种复合酶的菌株，采用固态发酵的方法，发酵非常规蛋白原料（血粉、棉粕、羽毛粉），并进行代谢试验。本研究主要包括如下四部分内容

2、：试验一，发酵菌种的分离与筛选：采用干酪素培养基进行初筛，从牛瘤胃内容物中分离和筛选出株产透明圈较人的菌株，利用它们发酵乍常规蛋白原料，最终确定菌株具有高效的发酵能力。利用固态发酵非常规蛋白原料，使可溶性蛋白质含量提高了，氨基氮含量提高了倍，并且该菌高产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶。经形态学初步鉴定为米曲霉。试验二，米曲霉同态发酵产蛋白酶条件的优化及酶学性质研究：以中性蛋白酶的活性为优化指标，采用正交和单因素方差分析的方法，对米曲霉最适产酶的培养基组分和培养条件进行优化。结果表明：米曲霉产中性蛋白酶的最适培养基组成为：在麸皮：豆粕粉为：的基础培养基中，添加、：，培养基的含水率为。产酶最适培养条件为

3、：值为，接种量为，的三角瓶装干的培养基，最佳培养时间为。该酶的最适反应温度为，最适值为；该酶在较稳定，值在时比较稳定；、对该酶有激活和稳定作用，而、不同程度的抑制酶活性，其中强烈抑制酶的活性。在最佳发酵工艺下，蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活力分别为、。试验三、米曲霉同态发酵生产优质蛋白饲料工艺的优化：本试验采用正交及单因素方差分析的试验方法，以可溶性蛋白含量、氨基氮含量及酶活为考察指标进行综合评定，筛选出最优的发酵培养基配方和发酵条件。试验研究结果显示，最佳原料配方为：血粉、棉粕、羽毛粉、麸皮、玉米粉；最佳发酵条件：初始为，含水率为，接种量为，发酵时间为。在最佳发酵：艺的条件下，发酵产品的可溶性

4、蛋白含量、氨基氮含量、粗蛋白含量及游离氨基酸总量分别达到了、，比未发酵的产品分别提高了、；蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的活力分别为。由此可见，利用米曲霉司态发酵非常规蛋白原料可以明显提高它们的利用率，为解决当前蛋白饲料资源的不足提供重要的理论依据。试验四，发酵蛋白替代豆粕对从肉鸡日粮代谢率、肠道菌群及消化酶活性的影响：按河南农业人学硕二论文照体重、身体状况，把周龄的肉鸡随机分成五组，每组只，分别为对照组、发酵杂蛋白组（试验、组的发酵杂蛋白分别替代全价料中豆粕的、）、未发酵杂蛋白组（试验组的未发酵杂蛋白替代全价料中豆粕的、）。研究结果表明：与对照组相比，试验、组（发酵蛋白组）的营养物质的表观代谢率差

5、异不显著（），对肠道中乳酸菌的数量影响不显著（）；但可以显著提高肠道中米曲霉的数量，显著降低肠道中大肠杆菌的数量（），显著提高小肠中消化酶的活性（）。与试验组（未发酵蛋白组）相比，使用发酵蛋白能显著提高肉鸡臼粮中粗蛋白、钙、磷的表观代谢率（），肠道中米曲霉和乳酸菌的数量显著增加，大肠杆菌的数量降低（），并能显著提高小肠中消化酶的活性（）。关键词：蛋白酶；固态发酵；米曲霉；肉鸡；蛋白资源河南农业大学硕上论文：，：，：，；：，；”，河南农业大学硕上论文，：，；，（），：（），（，），（）（，），（）；，（）（，），（）；河南农业大学硕论文（）（）：；致谢本论文从选题、思路设计、实验方法、试验的开展

6、到论文的撰写都是在导师尹清强教授的精心指导下完成的，取得的每一点成果无不凝聚着尹老师的智慧和汗水。尹老师渊博的学识、严谨的治学态度、敏锐创新的科研思路和不断开拓进取的科学精神使我受益匪浅，也将是我人生中永远的航标。三年来，恩师不仅在学业上给予了始终如一的精心教诲和指引，在生活方面也对我关心备至，他是我人生旅途上最重要的启蒙者和领路人。从他身上我不但学到了很多专业知识，更重要的是为人处事的态度和方法。师恩似海，永生难忘。在此论文完成之际，谨向导师尹清强先生致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！本试验在具体操作、课题讨论、试验内容的安排及实施方面得到了师母郑秋红老师、常娟老师、师兄左瑞雨及实验室全体同学

7、的大力帮助，有的还参与完成了本论文中的部分工作，在此对他们表示衷心的感谢！感谢他们在学习和生活中对我的关心和帮助。衷心感谢动物营养和饲料科学导师组的林东康教授、康相涛教授、王成章教授、高腾云教授、王志祥教授、李振田副教授，黄艳群副教授，陈文副教授、田亚东副教授、史莹华副教授给我的指导和帮助，并对论文的开题和试验实施提出的宝贵意见。在此，谨向各位老师表示衷心的感谢！衷心的感谢郑州市佳禾生物技术有限公司的老总王卫民及全体员工，感谢他们在我试验过程中给予的支持和帮助！感谢父母多年来对我的抚养和教导，感谢我的女朋友张瑜多年来对我的理解与关心，是他们无私的奉献和支持使我得以顺利完成学业！最后谨将此文献给

8、我的家人和所有关心、支持我的亲朋好友。在我的漫漫求学路上，他们不仅在生活上无微不至地关心我、爱护我，而且在精神上给予我强大的支持和动力，正是他们一如既往的关爱使我有勇气和信心克服重重困难与挫折，在科学研究的道路上执着前进。河南农业大学硕：论文日吾我国是世界上最大的养殖生产国之一，同时也是世界上饲料原料特别是蛋白质原料的需求大国。随着我国饲料工业的迅猛发展，我国对饲料原料的需求量急增，使我国的饲料资源尤其是蛋白饲料资源更加紧缺，已经成为限制我国畜牧业发展的主要因素之一。如何合理开发和利用新的蛋白饲料原料，将对我国畜牧业的发展起剑至关重要的作用。我国非常规饲料资源种类多、数量大。但它们都存在着各种

9、各样的缺陷，若直接饲喂畜禽，其吸收利用率较低，如血粉、羽毛粉，其蛋白质基本上都是以大分子蛋白的形式存在，难以被畜禽消化吸收。而棉籽粕（饼）、菜籽饼（粕）等因含有毒素和抗营养因子，也不能够大量使用。因此，如何合理开发和利用这些非常规饲料原料成为世界各国研究的热点。大量的试验研究表明，采用现代生物发酵技术，开发和生产微生物蛋白饲料，是缓解我国优质蛋白饲料资源不足，发展畜牧业的一条有效途径。利用微生物对营养、环境高效的适应性和强大的转化力来减少抗营养因子及原料的毒性，并使原料中不易被动物分解吸收、利用的蛋白质、纤维素、果胶质、各类有机酸、淀粉等复杂大分子物质降解为易于被动物消化吸收的小分子物质，并形

10、成人量的菌体蛋白，大幅度提高原料的营养价值和利用率，并通过发酵来改善和提高饲料的适口性，促进畜禽的采食欲；同时由于微生物本身所产生的各类生物活性物质可以促进动物体内有益微生物菌群的生长，抑制有害菌群的繁殖，从而减少动物疫病的发生；并且微生物发酵技术在改善饲料品质，提高原料利用率，降低饲料生产成本，增加畜牧业经济效益等方面有显著作用。因此，本研究试图从牛瘤胃中分离筛选出高产以蛋白酶为主并产多种复合酶的菌株并对其产酶条件和酶学特性进行研究，然后采用固态发酵的方法发酵非常规蛋白原料，并进行相应的代谢试验，为解决当前蛋白资源不足提供一定的理论和试验依据。河南农业大学硕士论文第一章文献综述我国非常规蛋白

11、资源的现状非常规蛋白质资源的含义及特点非常规蛋白质资源是指在传统的动物饲养中未被作为主要蛋白质饲料使用过以及（或）畜禽商品日粮中一般不用的蛋白质饲料。非常规蛋白质原料与常规蛋白质原料相比具有如下几方面的特点：（）来源广泛，种类繁多，成分复杂；（）营养成分变异大，质量不稳定；（）适口性差，饲用价值低；（）含有多种抗营养物质及毒素，需经过特殊处理才能使用。我国常见的几种非常规蛋白质饲料资源我国非常规蛋白质饲料资源数量大、种类多、分布广。按来源不同可分为植物性蛋白质饲料、动物性蛋白质饲料、和单细胞类蛋白质饲料等三大类。植物性蛋白饲料（）菜籽饼粕：菜籽饼柏富含蛋白质，粗蛋白含量一般在之间，且氨基酸组成

12、与大豆饼粕近似，因此可作为畜禽极有潜力的蛋白质饲料资源。但菜籽饼粕品质变异较大，油菜的品种、产地及加工条件的变化都会引起菜籽饼粕品质营养物质有效性的改变。此外，菜籽饼粕含有许多有害物质和高水平的粗纤维等，它们会对畜禽健康产生不利影响，从而限制了菜籽饼粕的利用。冈此，菜籽饼粕的利用要进行合理的脱毒。菜籽饼粕的脱毒方式有酸碱处理法、氨处理法、紫外线照射法、微波处理法、坑埋法、浸泡法、蒸煮法、干热纯化酶法、菜籽饼粕与青贮玉米共同青贮法、发酵中和法及其它微生物发酵法等。这些方法中许多是通过水剂去毒，会产生大量含毒废液污染环境，干物质损失可达，但成本高，故虽有脱毒效果，但是不可行。氨、碱处理法在脱毒的同

13、时会破坏营养成分，饲养效果不好。其它方法也存在去毒效果差、不经济或不能进行工业化生产等缺点。微生物发酵法可以明显降低其毒性，并能显著提高其营养价值，但菌种的筛选及发酵工艺仍不完善。所以，工业化的菜籽饼粕脱毒工艺及相应的成套设备仍旧是未来几年内的研究重点。（）棉籽饼粕：棉籽饼是由棉籽为原料经脱壳、去绒或部分脱壳、去绒、再取油后的副产品。用浸提法或经预压后再浸提取油后的副产品则称为棉籽粕。棉籽饼柏蛋白含量一般在之间。棉籽饼粕中赖氨酸和蛋氨酸的含量均较低，缺乏维生素、，：和胡萝卜素，富含硫胺素，磷多钙少。主要缺乏赖氨酸，因为含量低，利用率也相应低。一般棉籽饼中含有大量的色素腺体，如对动物有害的棉酚。

14、因此，不宜大量添加到猪和家禽的饲粮中。另外，棉籽饼及棉籽油的残油中均含有的环丙烯类脂肪酸，它可以加重由棉酚引起的蛋黄变褐、变硬，并使蛋白呈粉红色等。棉籽饼柏的利用与菜籽饼粕相似，都需要进行脱毒处理。目前常用的脱毒方法有硫酸弧铁（铁盐）法、化学处理法、水热处理法、溶剂浸出法、膨化法和固态发酵法河南农业人学硕士论文等。工业上常用铁盐法、膨化法。但最近几年微生物发酵法的工艺和技术逐渐成熟。（）花生饼柏：花生饼粕是以脱壳后的花生仁为原料，经取油后的副产品。花生饼粕不含毒素，是良好的蛋白质饲料，精氨酸含量偏高，但是缺乏赖氨酸和蛋氨酸，当做饲料配方时，需要进行合理调配，才能使其成为上等的蛋白质饲料。花生饼

15、粕中的矿物质及微量元素的含量受原料、土壤地质条件的制约。相对于其他饼粕类，花生仁饼粕中钙、磷含量较低，总磷中的是植酸磷，难以被单胃动物吸收利用。花生饼粕不易贮存，极易感染黄曲霉而产生黄曲霉毒素，该毒素经蒸煮也不能被破坏。因此，花生饼粕不宜长期储存，一旦生有黄曲霉就不能再使用。花生饼是猪、鸡的优良蛋白质饲料，如果与动物性蛋白质饲料混合，效果更好。猪很喜欢吃花生饼，但花生饼中的赖氨酸和蛋氨酸不能满足猪的需要，所以应与其它动植物蛋白配伍使用。在猪的精料中一般不能超过，否则体脂变软，影响肉脂品质；肉鸡和蛋鸡配合饲料中可以添；。（）糟渣类：糟渣类主要是指醋糟、酒糟、酱油糟、玉米淀粉工业卜脚料、药渣、果渣

16、、柠檬酸滤渣、甜菜渣、废糖蜜、甘蔗渣、菌糠等。这些糟渣类除了水分含量较高之外，粗纤维、粗蛋白质、粗脂肪等的含量也较高，无氮浸出物含量较低，其粗蛋白质约占干物质的一以上，所以属于蛋白质范畴之内。蛋白质含量在以上，可以直接用作精饲料的如玉米蛋向粉和糟渣等，往往不需要另外处理，即可直接粉碎、干燥，制成粉状的高蛋白质。蛋白质含量低，且纤维成分较高，不宜直接作为蛋白饲料的渣类我们可以做成饲料填充料；或按比例配合成营养剂，然后制成粉状或颗粒状的预混饲料出售；或者先经过加酸加温水解成单糖，再经过微生物发酵制成糖化饲料或单细胞蛋白饲料。动物性蛋白饲料这类饲料主要来源于动物及其加工后的副产品。如血粉、羽毛粉、肉

17、骨粉等。这类饲料蛋白质含量多在之间，且赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量车富，品质好（评价蛋白质品质好坏，主要看必需氨基酸种类和含量，其中以鱼粉最好）；粗纤维应为零，但也可能混入少量植物性杂质；粗脂肪较高，加之高蛋白含量，故能值高；钙磷含量较高，且比例适当。（）羽毛粉：羽毛粉的蛋白质含量很高，大约在以上，其中羽毛粉蛋白中的含硫氨基酸的含量居所有天然饲料之首，如果制作方法合适，羽毛粉的消化率也可在以上。美国、英国和前苏联关于利用家禽羽毛作为蛋白饲料来源的研究已经相继进行了二十多年，结果表明，羽毛蛋白是一种有独特价值的优质蛋白饲料。我国每年可收集利用的羽毛杆下脚料约万吨，加工后用于饲料的不足万吨，且有下降

18、的趋势。大部分羽毛杆等动物毛发下脚料朱被合理利用，主要原因是羽毛粉加工技术不过关、产品消化吸收率低、质量参差不齐、导致饲养效果不佳等。我国羽毛粉主要采用以下几种方法进行产业化生产：高温高压水解法；酸、碱水解法；酶解法；微生物法等。以上方法由于工艺设备落后而效果不佳，产品的氨基酸消化率不稳定，生产成本偏高，目前比较理想的方法是通过多种微生物来发酵或是多种酶来综合处理，这样一方面可以提高某些氨基酸的含量，另方面也可向其中增加一些生物活性物质。河南农业人学硕士论文（）血粉：血粉是利用动物屠宰斤废弃的血液加：而成的一种良好的动物性蛋白质饲料。血粉中蛋白质含量很高，达以上。但是直接采用动物血或是经过简单

19、风干后的血制品来饲喂动物，其可消化性就很差，动物对其蛋白质的吸收率不到，而且血粉中所含有的氨基酸不平衡，虽然赖氨酸含量丰富，但是蛋氨酸和异亮氨酸的含量却较少。血粉铁含量很高，但钙、磷的含量却很少。国外对血粉制品的研究颇多，例如：等瞳（）报道，由于血粉产品中的组分变化比较大，所以在生长猪的日粮中添加不同来源的动物血粉制品，对猪的生产性能，影响差异比较大。等（）报道，动物蛋白制品中的微生物尤其是沙门氏茵的含量比植物蛋白要高的多，这可能是影响血粉畜禽饲养效果的主要原因之一。等（）报道，血粉干燥前的贮存时间会影响血液中值的高低和血液中氨气浓度的大小。国内外为了提高血粉的饲用价值，曾开展了大量的开发研究

20、工作，现在用来改进血粉饲用价值的主要工艺有：晾晒法、蒸煮法、喷雾干燥法、发酵血粉、膨化血粉、水解血粉和微生态血粉等。血粉作为饲料来源的潜力是巨大的，但是由于血粉的适口性差、消化率较低，故使用血粉作为畜禽饲料时以少量为宜，适宜用量人约为饲粮的。一般在猪、鸡饲粮中添加量不宜超过。¨（）肉骨粉：在卫生检验时，不合格的肉备屠宰体和内脏等经过高温、高压处理后，脱脂、干燥而制成的物质，我们叫做肉骨粉。其营养价值的高低取决于所用的原料。肉骨粉中氨基酸含量丰富，其中赖氨酸的含量尤其丰富，但是所含的蛋氨酸比鱼粉少；肉骨粉中含有丰富的营养元素，例如钙、磷和维生素等。据有关部门统计，我国屠宰厂（不包括个体

21、屠宰厂）下脚料每年产量大约三十余万吨，如果我们能将这些动物下脚料充分合理的开发利用起来，这将是一笔很大的财富¨。现在肉骨粉的处理加工方法中，比较常见的是应用压榨热喷技术对肉骨粉进行处理。此技术方法中产生的膨化效应和水解作用可有效的提高产品品质，增加营养元素的吸收率，同时又能降低有害菌指标、消除不良气味和破坏有毒成分以及改善适口性等们。但值得注意的是：年月日，欧盟基本上通过了欧共体内全面禁止使用动物肉骨粉作为饲料添加剂的决议，从年月日起，我国已禁止从欧盟国家进口包括肉骨粉、血浆粉和动物。卜脚料以及用这些原料加：制作的各类饲料】。单细胞蛋白饲料资源单细胞蛋白又称菌体蛋白或微生物蛋白（缩写

22、），是指细菌、真菌或某些低等藻类生物，在其生长过程中利用各种基质在适宜条件下，培养单细胞或丝状微生物的个体而获得的菌体蛋白，是食品工业和饲料工业的重要蛋白质来源制。营养丰富，蛋白质含量达；含有动物机体所必需的各种氨基酸，特别是植物饲料中缺乏的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量较多，生物学价值大大优于植物蛋白，其消化率高达；富含多种维生素。此外，的生产还具有原料来源广、繁殖速度快、生产效率高、占地面积小、不受气候影响等优点。河南农业人学硕士论文从现有的研究报道看，用来生产菌体蛋白的微生物有四人类即非致病和产毒的酵母、细菌、霉菌和藻类（赵健聪，）在实际生产中人们一般将这些菌种互相配伍，采用混菌种发酵的方式

23、进行生产。其优势在于多个菌种之间可互相补偿其缺陷，进行协同互生发酵（张常霞，）引。菌体蛋白作为一种动物蛋白源，除了具有价格优势以外，还含有大量的有益菌、外源性消化酶、未知生长因子等。但是，在使用菌体蛋白作为蛋白质饲料时，其安全性是一个非常重要的问题。目前使用的微生物菌体蛋白产品为多菌种的混合物，所以，对微生物菌种的监控是保证产品安全的关键。其次，因基因重组等高新技术在菌种改良中的应用，对该项技术的安全性评价问题有待于解决。第三，有害微生物、氢氰酸、重金属（汞、铅）污染也是菌体蛋白饲料安全性问题的重大隐患。另外需要注意的是，单细胞蛋白中的核酸含量过高，这会增加肝脏中嘌呤的代谢率，容易导致动物代谢

24、失衡和尿结石。因此，我们将单细胞蛋白作为饲料原料时，要严格控制其添加比例，尽可能减少单细胞蛋白所带来的潜在危害。微生物固态发酵开发非常规蛋白原料的研究现状微生物蛋白饲料的分类微生物饲料大体上可分为两人类，一类主要是利用微生物的发酵作用改变饲料原料的理化性状，增加其适口性，并提高消化吸收率及其营养价值，或解毒、脱毒，或积累有用的中间产物。这一类微生物蛋向饲料主要包括畜禽屠宰废弃物发酵饲料、饼粕类发酵脱毒饲料、微生物发酵生产的各类饲料添加剂、乳酸发酵饲料（青贮饲料）等。另一类微生物饲料是利用来源广泛的废弃物、矿物、纤维素及糖类资源培养的微生物菌体蛋白。具体有：饲料酵母、石油蛋白、菌体蛋白饲料、食用

25、菌菌丝体、白地霉，以及微型藻、光合细菌饲料等。微生物发酵饲料和菌体蛋白饲料这两类不可截然分开，发酵饲料中也包含着营养丰富的菌体蛋白，而菌体蛋白的粗制品尤其是同态法生产的菌体蛋白饲料，亦包含有菌体之外的其他成分引。固态发酵菌种的选择菌种是发酵必不可少的物质，菌种筛选直接决定了发酵的成败和发酵效果的优劣。菌种性能对发酵产品的质量、蛋白转化利用率、发酵参数的控制等都起到决定性的作用。所选菌种必须符合以下条件：（）能充分分解、利用饼粕、糟渣类及动物下脚料等纤维和大分子蛋白，并能在其上较好生长，且安全、无毒副作用；（）生长、繁殖速度快，以求尽可能缩短发酵周期：（）菌种遗传性能稳定，能在较长时期保持优良的

26、性能；（）对其它菌株不拮抗；（）对环境适应性强。从现有的研究进展看，利用微生物单一菌株或组合菌株发酵，实现高蛋白菌体饲料的生物转化，已经取得了一定的研究成果。微生物蛋白饲料的生产菌种具有种类多和采用多菌种组合发酵的特点。其优势在于多个菌种之间可互相补偿其缺陷，进行协同互生发酵。大量的事实表明，微生物发酵法是加工各种原料最为经济、最为有效的方法，所以微生物在新饲料资源开河南农业人学硕七论文发中的地位是非常重要的。在年时，美国就批准了种被认为是安全、有效的微生物“，我国农业部在年月公布了嗜酸乳杆菌、啤酒酵母等种可作为饲用的微生物，此外还有研究和应用新菌种的报道，如腊样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌

27、8;圳和同氮菌等。根据各种有关的资料报道，以下菌种经常被选为发酵剂菌种旧地引。（）芽孢杆菌：芽孢杆菌是一种普遍存在的好气性细菌，其生命过程中能以孢子体形式存在，易于生产和保存，为发酵程中常用菌种，这类菌可以产生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和降解植物性饲料中的非淀粉多糖酶等。这些酶都具有较强的水解酶活性，可促进动物对营养物质的消化吸收。芽孢杆菌还可产生多肽类抗菌物质，来抑制病原菌。由于芽孢杆菌中具有不易致死的芽孢，故饲喂时以活菌状态进入动物的消化系统，可抑制肠道中有害菌的生长繁殖，而且在生产加工特别是干燥过程中不易死亡，有利于产品的运输和保藏。目前饲用微生物生产中应用的主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌

28、、腊样芽孢杆菌和需氧芽孢杆菌等。（）酵母菌：酵母菌一般为单细胞的子囊菌，其繁殖方式有无性繁殖和有性繁殖的不同。无性繁殖时，酵母菌有出芽生殖和分裂生殖两种方式，其中出芽生殖是最普遍的繁殖方式。酵母菌具有特有的色、香、味，作为发酵剂的菌种来发酵蛋白饲料后使其适口性好，而且发酵过程中耐酸能力强，适宜于低值培养，并且不容易污染，回收率高。酵母菌可分泌多种活性水解酶，菌体蛋白含量高，可达，而且富含族类维生素，并能产生促进细胞分裂的生物活性物质，有强化营养和抗病促长的效果。适于发酵蛋白饲料的酵母菌主要有啤酒酵母、产朊假丝酵母和热带假丝酵母等。（）霉菌：丝状真菌统称为霉菌。霉菌真菌可以分泌丰富的酶类，例如淀

29、粉酶、纤维素酶、蛋白酶和果胶酶等，这些酶类能够促使原料中的高分子化合物淀粉、纤维素等分解为单糖，来供给微生物生长的需要，且霉菌中菌体蛋白质的含量可达。因此，在蛋白饲料的生产中霉菌被广泛使用。主要被应用到饲料生产的霉菌有黑曲霉、白地霉、绿色木霉、康氏木霉、毛霉和黄曲霉等。（）乳酸菌：乳酸菌是寄生在动物胃肠道内常的有益菌群，其可产生有机酸、过氧化氢、酶类和乳酸菌素等多种物质。乳酸菌分泌的有机酸包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等，这些酸类物质本身既是营养物质，又可降低肠道值，对病原菌和腐败菌有抑制作用。乳酸菌分泌的过氧化氢和乳酸菌素对病原菌也有抑制和杀灭作用，从而减少了内毒素等有害物质的含量，使有益微生物

30、在竞争中占优势，从而非常有利于动物的生长发育，因此乳酸菌被广泛用作微生物添和饲料发酵剂。固态发酵技术研究进展固态发酵的含义和特点固态发酵又称固体发酵，狭义上讲固态发酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做同体支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程：广义上讲固态发酵是指一类使用不溶性同体基质来培养微生物的工艺过程，既包括将固态悬浮在液体中的深层发酵，也包括河南农业人学硕十论文在没有（或几乎没有）游离水的湿同体材料上培养微生物的丁艺过程（等，）。多数情况下是指在没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性同态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。与其他培养方式相比，

31、固态发酵具有如下优点：（）培养基简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或工业生产的下脚料；（）投资少，能耗低，技术较简单；（）产物的产率较高；（）基质含水量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便；（）发酵过程一般不需要严格的无菌操作。由丁【司态发酵厂“泛应用于同态废弃物的处理，可生产单细胞蛋白、抗生素、酶制剂、有机酸、食品添加剂、生物饲料和生物农药，是一种解决能源危机、治理环境污染、解决人畜争粮问题的有效途径，是绿色生产的主要工具。因此，世纪年代以来，随着世界性的能源危机的出现和环保意识的增强，固态发酵受到人们的普遍重视。固态发酵工艺的一般流程同体发酵生产的主

32、要工艺过程大致有以下五个部分：菌种扩大培养、原料预处理、接种发酵、干燥、成品包装。具体过程如下：斜面菌种活化培养一扩大培养一菌种待发酵原料一灭菌处理一调制一接种混合一发酵一千燥一成品从上述过程来看，同态发酵部分主要包括培养基的预处理、混配料、调制灭菌、接种以及固态发酵设备发酵等工序陋。固态发酵过程的控制参数分析固态发酵过程会涉及很多不同的参数，各参数对整个发酵都有不同程度的影响。经分析，整个过程中对发酵影响较大的参数有：物料成分、温度、物料含水量、氧气含量、发酵周期、值等。（）物料成分：固态发酵生产蛋白饲料所用基料大多是含有动物下脚料、渣粕类、淀粉或糖的农副产品和工业废渣等。微生物要在其上进行

33、生长并产生代谢产物，必然会受到反应物料本身的物理冈素（几何形态、表面积大小、颗粒大小、颗粒含有孔隙体积的大小等）、化学因素（聚合度、结晶度、亲、疏水性等和化学性质等）和额外添加的无机氮及微量元素等的影响。目前研究较多的是物料颗粒大小、其孔隙大小、无机氮、微量元素等对固态发酵的影响。物料颗粒大小直接影响到单位体积颗粒所能提供的反应表面积的大小，也会影响到菌体是否容易进入基质颗粒的内部及氧的供给速率和代谢产物的移出速率等。在固态发酵生产蛋白原料中，一股选用麸皮作为辅料（麸皮主要是作为一种膨松剂，同时也可作为辅助氮源）和些碳水化合物（如玉米粉），来增进菌株的生长；培养基中可加入少量无机营养盐，提供磷

34、、钾、硫等，使微生物快速生长从而分泌适当的酶分解底物获得养分。氮源通常添加尿素、硫酸铵、等进行蛋白氮的转化，但有研究发现，尿素的加入可使发酵培养基的值升高，这不利于菌体的繁殖和代谢，且在固态发酵生产培养基中氮源的加入量也不宜过高，这是由于尿素和硫酸铵河南农业大学硕士论文等为非蛋白氮，分子量较小，溶液渗透压较高，当其超过一定浓度时对菌体的生长和增殖不利。无机盐的加入量也不是越多越好，加入的浓度过低，菌种生长缓慢；加入的浓度过高，又抑制菌体生长。具体适合的碳源和氮源及它们的适宜比例要根据相麻菌株进行优化试验旧刖。（）温度：发酵温度是发酵过程中影响有机生长繁殖最重要的冈素之一，任何生物化学的酶的反应

35、都是直接与温度变化有关。在司态发酵过程中，微生物需要适宜的生长温度（真菌生长的最适温度为）。发酵过程中伴随微生物生长，会产生大量的反应热，但又因为固态发酵传热率差，易导致床温急剧上升训（真菌致死温度在），如果产生的热不能及时散去，温度就会影响菌株生长和产物的产率。此外，在同态发酵的过程中还要注意温度梯度，传热困难使发酵体系很难维持在最佳温度，在微生物生长对数周期内，同体物料层温度可超。较普遍的控温方法是把通气、温度、湿度控制相结合，通过通风冷却和恒温循环冷却水系统控制同态发酵温度并且控制好发酵时间。（）物料含水量：同态发酵最大特点就是无游离水。水是发酵的主要媒质，会直接影响剑微生物生长状态、营

36、养物质的扩散及利用、氧和二氧化碳的交换等，介质含水量大小随菌种及原料而异（等，）¨。物料含水量过高，会影响透气性，使发酵物料内部散热难，易造成杂菌污染；而含水量低，造成物料膨胀程度低，微生物生长受抑制。后期由于水分的蒸发、微生物生长代谢活动和通风等因素的影响，而造成物料较干，微生物难以生长，产量降低。一般情况下，同态发酵时底物起始含水量在左右（等，）口引。发酵起始阶段，发酵底物的含水量可以适当高一些。因为随着发酵的进行，水分不断蒸发，底物含水量会不断下降。（）氧气含量：固态发酵利用的微生物儿乎都是好氧性的，氧气的供应是发酵能否成功的重要限制参数之一。通风可以增加氧的传递，还有利于热交

37、换。翻动或搅拌虽可防卜物料结块，且利于热交换，但过分的翻动或搅拌会影响菌体与基质的接触，并可能损伤菌丝体，使水分蒸发过多而使物料变干，抑制菌体生长。在实验室及工业化大生产中，一般利用强制通无菌空气来达到通风的目的。但是通风的速率由以下因素决定：微生物的特性、合成产物对氧的需求程度、发酵反应产生的热量多少、底物的料层厚度、微生物产生二氧化碳和其它易挥发代谢产物的量、底物间的空隙大小等引。通风率增加，底物的含水量降低，导致底物干燥，相应的空气加湿的时间变长。可以用气相色谱或氧分析仪来分析氧的浓度，根据情况及时调节强制通风的速率。（）发酵周期：发酵周期是指发酵从开始到结束的时间，发酵终点的判断对提高

38、产物的生产量有非常重要的意义。在发酵过程中，产物的浓度不是一成不变的，一般情况下，产物高峰生成阶段的时间越长，整个发酵生产率也就越高，但到一定发酵时间后，产物产率提高减缓，甚至下降。因此，无论是获得菌体还是代谢产物，微生物发酵都有其最佳时间阶段。时间过短，不足以获得所需的产量；时间过长，由于环境已不利于菌体生长，往往造成菌体自溶，产量下降，同时增加生产成本。所以适宜的发酵时间一定要考虑具体的菌种、工艺条件和产物，通过试验来确定。河南农业人学硕十论文（）值：值的变化与发酵的关系极为密切，对菌体的生长繁殖和产物积累的影响极大，但是在吲态发酵过程中很难有效控制。目前研究同态发酵过程中值变化，尤其是值

39、调控方面的研究比较少，通常采用具有缓冲性能的底物以减少对值控制的需要。另一个比较新颖的方法是以含氮无机盐（如脲）做氮源，以抵消发酵过程中酸的生成带来的负面影响。微生物发酵生产优质蛋白饲料的研究进展微生物发酵蛋白饲料的来源相当丰富，有工农业生产的废水渣如酒糟、酱油渣、淀粉渣、糖蜜等，纤维素类物质如木薯、玉米秆、豇豆藤、米糠、木屑等，菜籽、棉籽饼粕、桐饼、芝麻饼等蛋白质的下脚料，屠宰厂废弃的毛、血、骨、皮等，鸡、猪等畜禽粪便，鱼虾等海产品深加工产生的废弃物。利用有益微生物同态发酵的技术，对动植物蛋白原料进行发酵可以明显改变饲料原料的理化性状，减少抗营养因子明显并降低原料的毒性，改善其适口性，提高蛋

40、白质含量，使氨基酸含量趋于平衡，维生素丰富，含有一些有益菌及未知生长因子等，营养价值大大提高等等。植物性蛋白饲料的研究进展对发酵植物性蛋白原料的研究多集中在降低其抗营养因子和提高含量两方面。如中山大学生物系钟英长等忸引（）人从自然界霉变棉籽饼中，分离筛选出对棉酚有耐受能力的霉菌，接种在棉籽中发酵，脱毒效率达一，总脱毒率在以上，并使棉籽饼的粗蛋白含量提高了。并在此基础上研制了微生物固态菌种发酵脱毒法，该法具有脱毒率高、发酵时间短、投资小、成本低、工艺简单、发酵过程能增加生物活性物质、改善营养及适口性等特点。浙江大学顾赛红等啪（）用黑曲霉对棉籽柏进行固体发酵，使棉籽粕的粗蛋白提高了，必需氨基酸除精

41、氨酸外均增加，尤其是赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸分别提高了、和；发酵后棉籽粕的干物质、蛋白质和氨基酸等养分体外消化率也明显提高，其中粗蛋白、赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的体外消化率分别提高了“、和。董绪燕等（）采用枯草芽孢杆菌对菜籽饼粕进行发酵，在最佳发酵条件下，菜籽饼粕中硫甙、异硫氰酸酯和恶唑烷硫酮得到完全降解，产生较高的溶栓酶，有利于提高油菜饼粕的附加值，为大量菜籽并判断综合利用开辟一条崭新的途径。钟世荣等（）利用曲霉菌，采用菜籽饼粕与酱油渣混合发酵生产蛋白饲料，异硫氰酸酯和恶唑烷硫酮的总脱毒率可达，提高，粗纤维下降，适口性改善。等¨钔（）利用少孢根霉固态发酵菜籽粕，降低了，粗蛋白含量增加。王冬梅等（）利用技术固体发酵啤酒糟生产蛋白饲料，发酵后产品提高，总提高，粗纤维含量降低。王晓杰等¨（）用好食脉孢霉对玉米酒糟进行同态发酵，生产新型