纤维素酶及其在生产燃料酒精中的应用

1、纤维素酶及其在生产燃料酒精中的应用摘 要:植物利用二氧化碳，通过光合作用产生的木质纤维是地球上最丰富、最廉价而又可再生的资源。木质纤维主要成分是纤维素和半纤维素，纤维素和半纤维素的利用一直是研究热点课题。而纤维素酶能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖，最终经过发酵产生生物酒精。因此，寻找高效低价的纤维素酶，然后利用它来生产酒精，这对于解决人类文明发展的能源与环境问题具有化时代的意义，具有广阔的发展前景。关键词: 微生物;纤维素酶;燃料酒精；发展前景Celluase and its using on the Production of BioethanolAbstract:Lign

2、ocelluloses are the most abundant and cheapest sources of carbohydrate,continually replen-ished by photosynthetic reduction of carbon dioxide with sunlight energy, its composed by cellulose and hemicellulose. To date, how to make use of this resource is the hot topic for research.Cellulase enzymes c

3、an effectively hydrolyze cellulose to glucose in maize straw, which can produce ethanol for the energy after fermentation.Therefore, the search for efficient and low-cost cellulase,and then use it to produce alcohol,which has great significance and a broad development prospects in solving energy and

4、 environmental issues during the development of human civilization.Key words:microbe;cellulose,bioethanol; development prospect能源与环境问题制约着人类文明的发展。近几年来，可持续再生的生物能源研究与应用取得了巨大的进展，其中生物酒精成为一种可替代石油、廉价环保的能源。目前生物酒精主要是采用淀粉为原料生产的，成本价是汽油的两倍。为此，利用纤维素酶以富含纤维素的生物废料为原料生产酒精的生产技术已经成为研究的热点，全世界已有几十套中试生产线或试生产线。其中，生产上的主要障碍

5、是酶解成本过高，占总生产成本的40%55%，只有在酶的成本降低至1/10，投资成本降低30%，利用纤维素酶生产出来的酒精才能与石油相竞争。因此，生产高效低价的纤维素酶对于其在生产酒精工业上的运用具有重要意义。1 纤维素酶的组成、结构及作用机制1.1纤维素酶的组成1.2纤维素酶的结构纤维素酶分子普遍具有类似的结构,由球状纤维素催化结构、纤维素结合结构域和连接桥3部分组成2。纤维素酶中最大的功能区是催化区，它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。不同来源的纤维素酶分子大小差别很大，但它们的催化区的大小却基本一致。纤维素酶的结合结构域主要维持酶分子的构象稳定性，调节酶对可溶性和非可溶性底物的结

6、 合专一性；连接桥可保持球状纤维素催化结构和纤维素结合结构域之间的距离,有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体。1.3纤维素酶的作用机制一般地，外切酶作用于不溶性纤维表面，使形成结晶结构的纤维素长分子链开裂，长链分子末端部分发生游离易于水化；内切酶则作用于经外切酶活化的纤维素，分其-1,4键，产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖；而-葡萄糖苷酶再将纤维二糖、三糖等分解成葡萄糖，完成协同反应全过程2。当然协同作用顺序不是绝对的，各酶的功能也不是这样简单、固定的。2 纤维素酶的来源及微生物产生纤维素酶的特点2.1 纤维素酶的来源纤维素酶的来源非常广泛，原生动物、软体动物、昆虫和植物的一些组织等能产生纤维

7、素酶，丝状真菌、细菌和放线菌等在一定条件下也能产生纤维素酶。微生物以外的生物生产纤维素酶缺乏大规模应用的实际意义，因此在工业生产中都利用微生物来进行该酶的生产。2.2 微生物产生纤维素酶的特点细菌生产的纤维素酶的活力较低，并多数不能分泌到细胞外。在细菌中，目前对生产高温纤维素酶的耐热梭状芽胞杆菌和作为基因工程菌的大肠杆菌产生纤维素酶研究较多。丝状真菌具有产酶的诸多优点:产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和纯化；产酶效率高，且产生的纤维素酶酶系结构较为合理，酶之间有强烈的协同作用；同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。从纤维素酶的工业化制备及其应用的角度，研究和采用丝状真菌产酶具有更大的

8、意义。丝状真菌中，酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉等。从目前的研究进展来看，由于里氏木霉 Rut C30和 QM 9414 同时具有较为稳定的性状、优质高产纤维素酶的能力和较好的“抗代谢阻遏”能力，因此，它们被认为是最具有工业应用价值的菌株6。3 纤维素酶的生产工艺3.1 发酵制备纤维素酶纤维素酶是诱导酶，发酵过程中纤维素酶的大量合成必须有诱导物的作用。纤维素、纤维低聚糖及其他结构类似物均可作为纤维素酶的诱导物。因此，用于纤维素酶发酵制备的培养基，首先必须加入这些物质。为降低成本，简化诱导物的制备工艺，通常采用富含这些物质的原料(包括植物纤维原料、各种酒糟、乳糖、淀粉水解糖等)作碳源，

9、使产酶过程中充当碳源的物质同时起着诱导物的作用。除碳源外，还要加入适当的氮源，同时注意碳氮比的合理搭配，因为低碳氮比将导致培养初期菌体的过快生长和对碳源消耗过快，高碳氮比将由于氮源不足而出现菌生长繁殖太慢。纤维素酶的生产可采用固态发酵或液体深层发酵两种工艺。固态发酵法具有投资少、工艺简单、价格低廉等优点，然而固体发酵法存在很大的缺陷，以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取、精制，而且此法所产生的酶制剂外观粗糙且质量不稳定，生产效率较低，易污染杂菌，不适于大规模生产。液体发酵生产时，将原料送入发酵罐内发酵，同时接入纤维素酶菌种。发酵过程中，需要从发酵罐底部通入无菌空气对物料进行气流搅拌，

10、发酵完后的物料经过处理可得到纤维素酶产品。液体发酵虽有发酵动力消耗大、设备要求高等缺点，但液体发酵对原料的利用率高、生产条件易于控制、产量高、工人劳动强度小、产品质量稳定，可大规模生产。因此，目前此方法是大规模生产的可行方法。其生产流程图5如图1所示：图1 典型液体深层发酵纤维素酶生产工艺流程图3.2 纤维素酶的分离纯化粗纤维素酶液的提纯可采用蛋白质提纯的常用技术，包括热失活分离提纯法、分级沉淀法、层析法、离子交换法和超滤法等。工业上用于生产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸按盐析法、酒精沉淀法、丹宁沉淀法和离心喷雾干燥法等方法。4 利用纤维素酶生产燃料酒精加入纤维素酶，利用纤维素原料生产燃料酒精，

11、能解决能源危机、环境污染和资源浪费问题。工业上利用纤维素原料生产酒精的工艺流程如下：酸或酶 酵母 纤维素原料预处理水解糖化酒精发酵酒精4.1 纤维素原料的预处理方法在进行酶解前对木质纤维素进行预处理，可以破坏其结晶结构，提高酶的结合性和催化水解率。目前，物理方法预处理已研究的有机械粉碎、高压热水预处理、蒸汽爆碎处理、微波照射和辐射处理等。传统的物理处理等方法不仅耗能较多，而且不同程度的存在环境污染，难以在大规模工业化生产中应用。而常用的化学预处理方法有酸法预处理和碱法预处理等。4.2 水解糖化过程及发酵产生酒精在水解糖化过程中，可以用酸或者纤维素酶进行，但是酸水解过程要求容器是防腐蚀、耐酸、耐

12、压的，容器体积也较大。另外，酸水解常会伴随生成有毒产物乳糖醛、酚类等物质，需要改善工艺，减少这些物质的产生。酶水解产率高，而且副产物很少，对于进一步的乙醇发酵减轻了提纯的工作量，具有更好的应用价值。加入纤维素酶后，纤维素首先被纤维素酶Cl和Cx分解为纤维二糖，然后由-葡糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖，葡萄糖由酵母发酵生成乙醇，反应式如下:C1-Cx -葡萄糖苷酶 酵母 纤维素纤维二糖葡萄糖酒精葡萄糖对-葡糖苷酶有阻碍作用，纤维二糖对C1-Cx有阻碍作用，随着发酵的进行，葡萄糖不断为酵母所利用，这些阻碍作用就会逐渐降低，纤维素在纤维素酶作用下不断生成葡萄糖，为酵母作用生成酒精。但是，纤维素的酶解需

13、要大量的纤维素酶，而且酶的成本很高。因此工业化利用纤维素酶生产酒精还需要寻求廉价多产的酶源。5 纤维素酶研究的技术进展5.1产酶菌株的选育及诱变育种利用物理、化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞或孢子是选育高产突变种行之有效的方法，至今仍是育种的有效方法之一。崔福绵等从生霉棉布上分离出的康氏术霉CP88105经加热和亚硝基胍处理后，获得一株高产突变株CP88329。在固体培养基上28培养72h，所产纤维素酶复合物具有高的酶活力，产酶活力水平均为出发菌株的3倍。在用纤维素类原料发酵酒精方面，韩如等利用纤维素粘附厌氧滚管的方法得到了直接转化纤维素产乙醇的菌株Clostridium sp.EVA4，用

14、1%纤维素滤纸培养120h后，该菌株产乙醇浓度为1123mg/L，纤维素降解率为59%。5.2重组DNA技术用基因工程技术构建含纤维素酶基因的克隆菌株，表达具有较高酶活力的纤维素酶。如Kondo等将带有葡萄糖糖化酶基因的表达质粒pGA11导入酵母菌宿主YF207中，得到的菌株YF207/pGA11可在超过300h的条件下连续高产酒精且浓度达150g/L；能快速有效利用纤维二糖高产酒精的重组菌(Klebsiella oxytocaP2)，在利用10%葡萄糖和10%纤维二糖发酵产乙醇时，乙醇得率达到理论得率的96%以上；通过基因工程手段将相应的水解酶基因转移到Z.mobilis中，使得该菌株能够利

15、用木糖、甘露糖、乳糖甚至淀粉、纤维素等多种碳源；早在1986年，Pina，Calderon通过原生质体融合法，将发酵结合酵母菌株与酿酒酵母进行属间融合，前者有可利用纤维质物质，耐高温的特性，融合子具有双亲特性，可利用乳酸与纤维质原料做碳源制酒，性能稳定。在生产酒精行业中，还必须培育出耐高糖、高渗而又有较高发酵能力的酵母用于生产。6.利用纤维素酶生产酒精的发展前景6.1进一步选育高产复合酶系菌株由于纤维素酶是复合酶系，目前发现主要以上述3种成分为主，但是实际应用中对纤维素的分解仍然不彻底，尤其是对天然纤维素原料。再则由于自然界中的菌株产酶性能不高、各菌株酶组分活性各异、且存在某种特定组分酶活性较

16、低的缺陷。所以目前资料中报道的所 选育出来的菌种应用于生产还不是很理想。有待进一步筛选出产酶更高、更全面的菌株。通过把握不同菌种采用不同诱变光的强度、照射时间等处理条件，发现更好的、更理想的方法来实现提高菌株产酶。6.2纤维素酶分子水平研究得到突破基因工程技术已用来克隆、表达具有较高酶活的纤维素酶。由于纤维素水解需要多种酶成分的协同作用，而目前基因工程纤维素酶功能单薄，不足以彻底降解纤维素。因此，以后的基因工程纤维素酶既要克服木质素、木聚糖的障碍，又能克服反馈抑制作用。利用酿酒酵母具有把葡萄糖转化为酒精的能力，将3类主要纤维素酶基因导入酿酒酵母，实现纤维素直接转化生产酒精，还可生产SCP、多糖

17、等产品。但是，要获取具有全纤维素酶的高产菌株，原生质体融合技术是理想的育种途径。它可打破物种间细胞不能相互融合的障碍。通过细胞融合，就能获得既能分解纤维素，又能分解木质素的稳定的杂种菌株，构建具有纤维素分解能力的酿酒酵母菌也势在必得。6.3工程菌技术条件的进一步成熟含纤维素原料的酶解糖化与酒精发酵在同一反应器中连续进行时，除了消除葡萄糖因浓度高对纤维素酶的反馈抑制，还要协调酶水解与酵母发酵的最适温度pH值、发酵特性等指标。同时以后成熟的工程菌会有3个显著特性:一是能提高酒精对糖的收率，以降低酒精生产的原料消耗；二是具有一定的耐温性，以提高发酵温度，降低大型发酵装置夏季高温季节的冷却费用；三是具

18、有很强的耐酒精性能，以提高发酵终点发酵液中的酒精浓度。7 展望生物多样性与人类生存密切相关已为人们所共识。由于微生物的多样性、传代生长速度快、培养可控性、生产成本低、易进行基因突变、克隆重组及高效表达等优点，使人类能很快获得优良的基因工程菌，微生物酶源无疑将会发挥更大的作用和潜力。相信在不久的将来极有可能直接以纤维素为原料制取酒精，从而从根本上变革传统的酒精生产工艺。尽管纤维素作为直接碳源进行的研究还处于初级阶段，但从目前的研究结果和发展趋势来看，纤维素酒精发酵对我们已不遥远。参考文献：1 刘春芬,贺稚非,蒲海燕,等.纤维素酶及应用现状J.粮食与油脂,2004,(1):15-17.2 王巧兰,

19、郭刚,林范学.纤维素酶研究综述J.湖北农业科学,2004,(3):14-18.3 王俊增.酒精生产中应用纤维素酶提高酒率的理论探索J.山东食品发酵,1994(4):28-30.4 肖春玲, 徐常新.微生物纤维素酶的应用研究J.微生物学杂志,2002,22(2):33-35.5 曾家豫,冯克宽.纤维素酶制备工艺的研究J.甘肃农业科技,2000(4):46-47.6 彭宇辉.纤维素酶的制备及其在食品工业中的应用J.企业技术开发,2000,(11):11-12.7 Baker J O, Adney W S, Thomas S R, et al. Synergism between purified

20、bacterial and fungal cellulases. Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides,1995,618:113-141.8 Himmel, M E, Adney W S, Baker J O, et al. Advanced bioethanol production technologies:A perspective. Fuels and Chemicals from Biomass,1997,666:2-45.9 高培基,曲音波,王祖农.纤维素酶解过程的分析和测定J.生物工程学报,1988,4(4):324.10 谢占玲, 吴润.纤维素酶的研究进展J.草业科学,2004(4):72-76.11 徐学万,张芳.纤维素酶的特性及其在食品工业中的应用J.粮食与食品工业,