蛋清蛋白酶解物的抗氧化_抗凝血酶活性及生化特性的研究_图文

1、蛋清蛋白酶解物的抗氧化、抗凝血酶活性及生化特性的研究杨万根,张煜,王璋,许时婴(江南大学食品学院,江苏无锡214122摘要:研究了蛋清蛋白酶解物可能具有的抗氧化和抗凝血酶活性。水解用酶为Alcalase2.4L 碱性蛋白酶和Pro-teaseN 蛋白酶;测定了4个水解度的酶解物(采用pH-stat 法控制反应终点而得到的抗氧化和抗凝血酶活性,分析了活性最高的酶解物的氨基酸组成和相对分子量分布。结果表明,ProteaseN 蛋白酶的酶解物活性要高于Alcalase 酶解物,在水解度为15%时抗凝血酶活性最高;两种来源的、水解度为15%的酶解物的7种必需氨基酸质量分数分别达到了48.11%与45.

2、80%,远高于天然蛋清的7种必需氨基酸质量分数35.65%,说明两种酶解物具有很高的营养价值。相对分子量分布显示两种酶解物(水解度为15%的多肽组成相似,因此活性的差异可能是因水解酶种类不同而导致的产物多肽的氨基酸序列不同的缘故。关键词:蛋清;酶解物;活性肽;抗氧化;抗凝血酶StudyonAntioxidantandAntithrombinAcitivitiesofEggWhiteProteinHydrolysatesandTheirBiochemicalPropertiesYANGWan-gen,ZHANGYu,WANGZhang,XUShi-ying(SchoolofFoodScience

3、andTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,ChinaAbstract :Theantioxidantandantithrombinpropertiesofeggwhiteproteinhydrolysateswerestudiedinthisexperiment.Four hydrolysateswithdifferentdegreesofhydrolysis(DHwereobtainedusingAlcalase2.4LandProteaseNbypH-statmethod.Theantioxidantandantithrombinpropert

4、iesofhydrolysatesweredetermined.Also,theaminoacidcompositionandthemolecular weightdistributionofhydrolysateswiththehighestactivitieswereanalyzed.TheresultsshowedthattheactivitiesofProtease NhydrolysatesarehigherthanthoseofAlcalasehydrolysates,withthehydrolysate(DH15%havingthehighestantithrombin acti

5、vity.Theaminoacidsanalysisresultsshowedthatthecontentsofsevenessentialaminoacidsintwokindsofhydrolysates withDH15%are48.11%and45.80%,respectively,muchhigherthanthecontent35.65%ofnativeeggwhiteproteins.Molecular weightdistributionanalysisresultsshowedthatthetwohydrolysateswithDH15%havesimilarpeptides

6、compositions.The differenceonactivitiesisduetoenzymespeciesusedinthehydrolysisforproducingpeptideswithdifferentaminoacidsequences.Keywords :eggwhite ;hydrolysates ;biologicalpeptides ;antioxidant ;antithrombin中图分类号:TS936.16文献标识码:A文章编号:1002-6630(200806-0202-06收稿日期:2007-07-06自由基会引起机体损伤变性,是机体的衰老、癌变、肺气肿

7、、糖尿病等一系列自由基疾病的病源。机体中存在着一些抗氧化物质,它们具有预防这些疾病发生的作用1。在自由基疾病病人的营养中,补充一些抗氧化物质也能起到控制病情的作用。化学抗氧化剂因为毒、副作用正逐步受到限制,因此低价、高效、低毒的天然食品抗氧化剂的开发成为研究热点。活性肽具有多种生理活性,其中抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基,保护细胞和线粒体的正常结构和功能,防止脂质过氧化的发生,在预防和治疗自由基诱发的疾病和抗衰老方面有广泛的应用前景。凝血酶是心血管疾病的重要作用因子,抗凝血酶肽在心血管疾病预防和治疗中有重要作用2。我国蛋品资源丰富,蛋清的利用有待开发3。蛋清蛋白酶解产物是蛋清蛋白经

8、蛋白酶水解后生成的多肽和氨基酸的混合物,多肽的生理活性取决于多肽的相对分子质量大小和氨基酸序列,而多肽的相对分子质量大小和氨基酸序列又与蛋白质水解所用的蛋白酶种类和控制的水解度大小有关系。本实验选用Alcalase2.4L碱性蛋白酶和ProteaseN蛋白酶水解蛋清蛋白,采用pH-stat法控制反应终点得到不同水解度的酶解物,分别考察这些酶解物的抗氧化和抗凝血酶活性,并分析酶解物的生化性质,为开拓蛋清利用新领域提供依据。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器冻干蛋清粉。ProteaseN蛋白酶Amano酶制剂公司;Alcalase 2.4L碱性蛋白酶Novo酶制剂公司;凝血酶、纤维蛋白原、二苯基苦

9、基苯肼(DPPH,分析纯Sigma公司;邻苯三酚(分析纯、邻二氮菲(分析纯中国医药(集团上海化学试剂公司;三羟甲基氨基甲烷(生化纯国药集团化学试剂有限公司;二硫苏糖醇(D T T,生化纯 M e r c k公司。722型分光光度计上海精密科学仪器有限公司; RE-52旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;Plus384酶标仪美国MolecularDevices公司;Agilent1100液相色谱仪美国安捷伦公司;4K15冷冻离心机美国Sigma公司;77585-306L落地式冻干机美国Labconco公司。1.2方法在磁力搅拌器搅拌下,配3L蛋白质浓度为4%(W/ W的蛋清粉溶液,用1N的NaOH或H

10、Cl调pH至10.0,迅速升温至85后保温变性30m i n。冷却至反应温度后,用1N的H C l调节至反应p H值。酶的反应p H和温度分别是:ProteaseN蛋白酶:pH7.0,55;Alcalase 蛋白酶:p H8.0,60。按3%(W/W,酶/底物蛋白质(ProteaseN或0.1ml/100ml溶液(Alcalase2.4L的加酶量开始反应。根据pH-stat法,在反应过程中加入1N 的标准N a O H维持反应液的p H不变,通过调节加碱量控制反应的水解度。到达预定的水解度后,在沸水浴中保持15min,冷却。100000×g离心,上清液旋转蒸发浓缩,冷冻干燥得到酶解物

11、。根据pH-stat方法4,如式(1计算DH。DH(%=B×N b×1/×1/MP×1/h tot×100(1式中,B为耗碱量(ml;N b为碱的摩尔浓度(mol/ L;为-氨基的平均离解度;MP为蛋白质质量(g;生产过程中碱的加入使酶解物中盐类物质增加,这些盐类会影响到生理活性测定实验结果,因此需要脱盐5。具体步骤如下:用无水乙醇预处理DA201-C大孔吸附树脂,洗至无酒精后装柱,上样,用紫外检测器在220n m波长下检测,灵敏度0.5,当流出液的O D值超过5时,停止上样,改用去离子水脱盐,直到洗脱液的电导率与去离子水一致。换用75%酒精洗

12、脱树脂至OD值5以下,将洗脱液旋转蒸发浓缩,然后冷冻干燥,得到脱盐水解产物。采用Lowery法6。将酶解物溶解在6mol/L盐酸中,110水解24h,蒸干盐酸,定容得水解液。采用Agilent1100高效液相分析仪分析水解液中氨基酸组成。高效液相色谱仪条件:色谱柱为C18柱(4.0×125mm;柱温为40;流速为1.0ml/ min;检测波长为338、262n m(蛋白质;流动相A为20mmol醋酸钠液,B为20mmol醋酸钠液-甲醇-乙腈(1: 2:2,V/V/V。酶解物溶液经0.45m微孔过滤膜过滤后上TSKgel 2000色谱柱,以细胞色素C(M W12500、抑肽酶(M W

13、6500、杆菌酶(MW1450、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189为标准品,测定酶解物的相对分子量分布。高效液相色谱仪条件:Waters600(配2487紫外检测器和M32工作站;色谱柱为TSKgel2000SWXL(300×7.8mm;流动相为乙腈-水-三氟乙酸(45:55:0.1,V/V/V;检测波长为220nm;流速为0.5ml/min;柱温为30。(1不同DH的蛋清酶解物对DPPH自由基的清除作用7准确称取10m gD P P H用无水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中,则DPPH浓度为0.1mmol/L,避光保存。将2ml5mg/

14、ml样品及2mlDPPH溶液加入同一试管中,摇匀,放置30m i n后用溶剂作参比测定其吸光度A t,同时测定DPPH溶液与2ml溶剂混合后的吸光度A c,以及2ml5mg/ml样品与2ml溶剂混合后的吸光度A b。按照式(2计算清除率,清除率越大抗氧化能力越强。以抗坏血酸(VC作阳性对照物。A t-A bDPPH自由基清除率(%=(1-×100(2A c(2不同DH 的蛋清酶解物对羟自由基的清除作用8A 样品-A 损伤羟自由基清除率(%=×100(3A 未损伤-A 损伤(3不同DH 的蛋清酶解物对超氧自由基的清除作用9按表1测定各个吸光度,样品浓度25mg/ml。反应在2

15、5恒温水浴中进行,加入邻苯三酚引发反应,准确反应10min,加入30l100mmol/L 的DTT 终止反应,记录1h 内325nm 处的吸光度(A,以A 2作对照测定A 1,以A 4作对照测定A 3。以抗坏血酸(VC作阳性对照物。按式(4计算各样品清除率。A 3-A 4超氧自由基清除率(%=(1-×100(4A 1-A 2酶标仪的测定温度设定为37,测定波长为405nm,测定时间10min,每隔30s 读一次数。反应底物为0.1%的pH7.4的纤维蛋白原溶液。用含0.12mmol NaCl的0.05mol/LTris-HCl(pH7.4缓冲液溶解样品、纤维蛋白原和凝血酶。往酶标板的

16、小井中依次加入40l 90mg/ml 样品和140l0.1%纤维蛋白原溶液,振荡混匀,然后加入10l12U/ml 的标准凝血酶溶液,振荡混匀,开始读数。选取动力学曲线中前后差值恒定的点为反应终点,采用式(5和(6计算酶解物对凝血酶的抑制率和抑制活性。A e -A iY=×100%(5A e -A o组号pH8.2050mmol/L 1mmol/LEDTA 去离子水(ml样品(ml0.2mmol/L邻苯三酚Tris-HCl缓冲液(ml水溶液(ml(用10mmol/LHCl 溶液配制,ml1.01.00.41.0表1超氧自由基的测定方法Table 1 Measurement method

17、 of superoxide radical-scavenging activityC eYV ei =(6V i C i数据处理采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析,用SNK 分析水解度间差异的显著性,显著性为p <0.05%。2结果与分析对D P P H 自由基的清除能力图1酶解物对DPPH 自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of hydrolysates on DPPH free radical504540355101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物D P P H 自由基清除率(%水解度(%不同水解度的酶解物对DPPH 自由基

18、的清除作用见图1。从图1中可以看出,所有酶解物都具有清除DPPH 自由基的活性,但水解度相同时,ProteaseN 酶解物比Alcalase 酶解物具有更高的活性。ProteaseN 酶解物的活性随D H 增加而增加,在D H 为20%时达到最高为48.27%±0.37%,超过阳性对照物VC 的47.59%±0.39%。Alcalase 酶解物的活性在DH 为10%时达到最大,为36.16%±0.75%。不同水解度的ProteaseN 酶解物它对羟自由基的清除能力对超氧自由基的清除能力不同水解度的酶解物对超氧自由基的清除作用见图3。从图3中看出,酶解物具有较高的清

19、除超氧自由基活性,两种酶解物在D H 为10%以后活性增加缓慢,甚至P r o t e a s e N 酶解物的活性在D H 为15%后下降。Alcalase和ProteaseN酶解物的最大活性点分别是DH为20%时的79.66%±1.12%和DH 为15%时的82.39%±0.88%,而阳性对照值是63.35%±0.76%。ProteaseN 的不同水解度的酶解物的超氧自由基清除能力存在显著差异,而Alcalase 酶解物在DH 为15%和DH 为20%之间无显著差异,其他水解度的酶解物之间存在显著差异。2.2酶解物的抗凝血酶活性酶解物的抗凝血酶活性见图4。从图

20、4看出,Alcalase 酶解物的抗凝血酶活性随DH 增加,DH 为20%时,Alcalase酶解物的活性最大点为11.04±0.21ATU/g pro。ProteaseN 酶解物的活性从DH 为5%开始增加,D H 为15%时达到最大,在D H 为20%时又减小,最大时的抗凝血酶活性为19.885±0.48ATU/gpro。不同水解度酶解物之间活性均差异显著。图3酶解物对超氧自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effect of hydrolysates on superoxide radical80706050405101520Alcalase酶解物Pro

21、teaseN酶解物超氧自由基清除率(%水解度(%图4不同DH 酶解物的抗凝血酶活性Fig.4 Antithrombin activities of hydrolysates with different DHs201510505101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物抗凝血酶活性(A T U /g p r o 水解度(%2.3氨基酸组成天然蛋清及其ProteaseN蛋白酶的酶解物(DH为5%与Alcalase(DH 为15%酶解物的氨基酸组成分析结果见表2。从表2可知,ProteaseN 和Alcalase 酶解物的氨基酸组成相似,其中天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、亮氨酸的质量

22、分数比较高,分别是9.43%与10.89%、11.28%与13.56%、10.41%与12.35%、12.25%与10.28%。两种酶解物的7种必需氨基酸质量分数分别达到了48.11%与45.80%,远高于天然蛋清的7种必需氨基酸质量分数35.65%。由于这些氨基酸在人体不能合成或合成的速度不能满足机体的需要,必须由食物蛋白供给,因此这两种酶解物具有很高的营养价值。迟玉杰等用大鼠喂养实验证明蛋清蛋白酶解物的营养价值优于酪蛋白,消化利用率较高,是一种理想的氮源11。两种酶解物的游离氨基酸组成分析结果见表3。可以看出,ProteaseN 的DH 为15%酶解物的游离氨基酸含量为4.193mg/gp

23、ro,小于Alcalase 的DH 为15%的酶解物的游离氨基酸含量(6.429mg/gpro。可能是因Alcalase 中含有少量外切酶引起。图2酶解物对羟自由基的清除能力33305101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物羟自由基清除率(%水解度(%氨基酸游离氨基酸含量(mg/gpro4.1936.429表3酶解物的游离氨基酸组成Table 3 Free amino acid compositions of hydrolysates 图5Protease N (DH 为15%酶解物的相对分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution of

24、hydrolysate prepared withProtease N (DH 15%5.003300A U时间(min21991415717260图6Alcalase (DH 为15%酶解物的相对分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of hydrolysate prepared withAlcalase (DH 15%5.003300A U时间(min21991418736268峰编号相对分子质量分布(D各峰值的保留时间(min所占比例(%407219.00028.83362.24表4Protease N (DH 为15%酶解物的相对分子质量分布

25、及相对含量Table 4 Molecular weight distribution and relative content ofhydrolysate prepared with Protease N (DH 15%名称相对分子质量分布(D各峰值的保留时间(min所占比例(%4113表5Alcalase (DH 为15%酶解物的相对分子质量分布及相对含量Table 5 Molecular weight distribution and relative content ofhydrolysate prepared with Alcalase (DH 15%2.4相对分子质量分布比例列于表4。可以看出,ProteaseN 的DH 为15%酶解物的相对分子质量分布在28638D 之间,其中数ProteaseN(DH为15%和Alcalase(DH 为15%酶解物的相对分子质量分布见图5、6,它们分别由多种不同相对分子质量的组分组成。为了更好地描述各组分的分子大小,引入数均相对分子质量来描述各组分的平均相对分子质