细胞培养技术

1、细 胞 培 养 原 理基础技能n无菌操作技术： 用于防止微生物进入人体组织(外科手术)或其它无菌范围的操作 技术称为无菌操作。在各种生物实验中，为了防止微生物生长和 繁殖影响实验的进行，也要在无菌的环境下进行。n 要求：操作前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭 操作过程中界面与外界隔离，避免微生物的侵入操作环境,器具,试剂的灭菌/消毒操作过程规范 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或 失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意， 技术操作不规范，也会导致污染。因而，为在一切操作中最大可能 地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 避免污染的方法（一

2、） 灭菌(sterilization) 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物（包括抵抗力最强的细菌芽孢）永远丧失其生长繁殖能力的措施。n灭菌常用的方法： 干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌和辐射灭菌等。 可根据不同的需求，采用不同的方法。 干热灭菌法:在干燥环境(如火焰或干热空气)进行灭菌的技术。n分类：n焚烧：用火焚烧是一种彻底的灭菌方法，破坏性大，仅适用于废弃物品或动物尸体等；n烧灼：直接用火焰灭菌，通常将灭菌物品迅速通过火焰34次。适用于实验室的金属器械(镊、剪、接种环等)、玻璃试管口和瓶口等的灭菌；n干烤：在干烤箱(hot air sterilizer)内进行，加热至160170维

3、持2小时，可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。适用于耐高温的玻璃器皿、瓷器、 玻质注射器等；n红外线(infrared)：是波长为770nm1000m的电磁波，以1m10m波长的热效应最强。红外线的热效应只能在照射到的表面产生，不能使物体 均匀加热，常用于碗、筷等食具的灭菌；n微波(microwave)：波长为1mm1000mm的电磁波统称为微波，可穿透 玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。微波炉的热效应 分布不均匀，灭菌效果不可靠，用于非金属器械及食具消毒。湿热灭菌：以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干

4、热灭菌法高。n湿热灭菌法分为：n煮沸灭菌法：灭菌效果较差，常用于注射器、注射针等器皿的 消毒。必要时可加入抑菌剂。n巴氏消毒法：利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中 营养物质风味不变。n流通蒸汽灭菌法：适用于消毒以及不耐高热制剂的灭菌， 但不能保证杀灭所有芽孢，是非可靠的灭菌方法。n间歇蒸汽灭菌法：方法同流通蒸汽灭菌法，但要重复3次以上。 不耐高热的含糖或牛奶的培养基。n高压蒸汽灭菌法： 将需灭菌的物品放在高压锅(autoclave)内，加热时蒸汽不外溢， 高压锅内温度随着蒸汽压的增加而升高。在103.4kPa蒸汽压下， 温度达到121.3，维持30min。 可杀灭包括芽胞在内的所有微生物

5、，灭菌效果最好。适用于普通培养基、生理盐水、手术器械(金属)、玻璃容器、离心管、EP管、枪头等耐高热物品的灭菌。松下-高压蒸汽灭菌器型号：MLS-3751L-PCu高压蒸汽灭菌法注意事项： n包裹不应过大、过紧，一般应小于30cm30cm50cm；n高压锅内的包裹不要排得太密，以免妨碍蒸气透入，影响灭菌效果；n易燃、易爆物品，如碘仿，苯类等，禁用高压蒸气灭菌；n锐性器械，如刀、剪不宜用此法灭菌，以免变钝；n瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口；如有橡皮塞时，应插入针头排气； -瓶口不能封死，以免被压变形n注明灭菌日期和物品保存时限，一般可保留l2周。过滤除菌： 用物理阻留的方法将液体或空气

6、的细菌除去，以达到无菌目的。 主要用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品及空气的除菌。 所用的器具是含有微小孔径的滤菌器(filter)。 n常用的滤菌器是薄膜滤菌器（0.45m和0.22m孔径）， 直接加在注射器头部。繁殖型微生物约1m，芽孢为0.5m或以下，支原体为0.10.8m。 辐射灭菌： 利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。n用于灭菌的电磁波有：n微波：可以通过热产生杀死微生物的作用。n紫外线：破坏微生物细胞中的DNA或RNA，抑制DNA的复制与转录。 -穿透力很弱，主要用来消毒。nX射线和射线： 射线的能量高、穿透力强，可使细胞内各种活性物质发生化学变化

7、，从而使细菌损伤或死亡。 -注意安全使用；成本高 常用的放射源：Co60-射线。（二）消毒(disinfection) ：指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。n常用的消毒法： n加热消毒法：加热使微生物细胞中的蛋白质凝固、酶失活。最常用的加热消毒法是煮沸。n药剂消毒法：用于消毒的化学药剂称为消毒剂。 常用的消毒剂75%酒精，0.2%新洁尔灭(苯扎溴铵)。n紫外线消毒：紫外线能够破坏微生物细胞中的DNA或RNA。缺点：紫外线穿透性差，光照强度随距离增大而降低。 主要应用于空气、物品表面的预防性消毒。（三）防腐(antisepsis)： 利用某种理化因素完全抑制微生物的生长繁殖。n常用

8、的防腐方法：n低温：冷藏(+4)、冷冻(-20 ,-80 等)n缺氧：烘干、紫外线干燥n高渗：盐腌、糖渍n防腐剂：大多数为化学合成产品，毒性较大。 -福尔马林(3540甲醛)（四）抑菌(bacteriostasis)： 抑制细菌、真菌的生长繁殖。n抑菌剂-抗生素(antibiotics)：由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。n抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染 的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。 不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。比较防腐剂抗生

9、素来源化工产品微生物天然产物/人工修饰作用目标大多数用于物大多数用于人作用方式外用内用毒性毒性很大毒性很低选择性选择性差选择性较好作用机理化学反应生物活性 甲醛：与蛋白质上的氨基发生反应 。 青霉素：与细胞壁成分-粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似， 可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的交联，造成细胞壁的缺损， 使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。培养前的准备工作n制定好实验计划，有关的数据计算要事先算好。n准备各种所需的器具和物品，清点无误后放于操作场所(培养室,超净工作台)，然后开始消毒。避免开始实验后，往返拿取物品而导致污染机会的增加。操作前的消毒n一些操作用具(如移液器、试管

10、架、离心管等)用75%酒精擦洗(喷洒酒精)后置于台内，随后开启紫外线消毒30min。n实验前，超净工作台台面要用75酒精擦洗。n工作台面消毒时，切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。操作过程中n在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，戴口罩。开始操作前要用75酒精消毒手。n如果实验过程中手触及可能污染的物品和伸出超净工作台外，都要重新用酒精消毒手。n在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。n之后的一切操作（如打开或封闭瓶口等），都需在 火焰近处并经过烧灼进行。 n进行培养时，动作要准确

11、敏捷，但又不必 太快，以防空气流动，增加污染机会。n不能用手触及已消毒器皿(如EP管,镊子, 剪刀)，可用无菌镊子夹取。n如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 细胞培养的基本过程 （一）取材： 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定)，经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后置于培养器皿中，这一过程称为取材。n 如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。n 机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。 n取材后应立即处理，尽快培养，因故不能 马上培养时，可将组织块切成

12、黄豆般大的 小块，置4的培养液中保存。n取组织时应严格保持无菌，同时也要避免 接触其他的有害物质。n取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时 容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。 （二）培养： 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程 称为培养。n细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入 培养器皿并直接加入培养基。n细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞 尽早进入生长状态。 n正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的 内容包括：细胞是否生长良好，形态是否正常，有无 污染，培养基的pH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示)，此外对培养温度和C

13、O2浓度也要定时检查。n原代培养一般有一段潜伏期(数小时到数十天不等)， 在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。 过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。n细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至2-3瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。n二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性。 细胞计数血球计数板：则盖上盖玻片后，每个大方格的体积为1mm2 0.1mm = 1.010-4 mL(cm3)细胞计数血球计数板：细胞数的计算公式：4(2)个大方格的总数4(2) 104 稀释倍

14、数则盖上盖玻片后，每个大方格的体积为1mm2 0.1mm = 1.010-4 mL(cm3)= 细胞数/mL 细胞培养基的基本要求(1)营养成分：n1. 氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸。 此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成3-,2-,1-磷酸酰苷所需要的基本物质。 体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸。n2. 单糖：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培

15、养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。 细胞培养基的基本要求(1)营养成分：n3. 维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。 生物素(B7)、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、 核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。n4. 无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、 钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素， 如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。 细胞培养基的基本要求(2)促生长因子及激素： 已证实各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促

16、进作用，如氢化可的松(糖皮质激素)可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。 细胞培养基的基本要求(3)渗透压： 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg(毫渗摩尔每千克)，可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260-320 mOsm/kg的范围都适宜。 例如 ：0.9% 的氯化钠的摩尔浓度为 154 mmol/L ，由于氯化钠可以完全电离成钠离子和氯离子，因此溶液中总的质点数目为 308 mmol/L，那么其渗透压为308 mOsmol/L。1mOsm/L

17、 = 2.573kPa(或19.3mmHg) 细胞培养基的基本要求(3)渗透压：渗透摩尔渗透摩尔（osmole）：一种量度单位，简写为Osm， 用以描述渗透活性物质渗透活性物质的物质的量物质的量。渗透质量摩尔浓度渗透质量摩尔浓度（osmolality）：渗透活性物质的质量摩尔浓度质量摩尔浓度,常用单位有Osm/kg和mOsm/kg。细胞培养基的基本要求(4)气体及pH： 细胞生存所需气体主要是O2和CO2。O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖 和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量， 但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95空气加5CO2 的混合气体

18、环境中培养。细胞培养基的基本要求(4)气体及pH：CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持 培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7.27.4。在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强， CO2不断被释放，培养液变酸，pH值发生变化。由于NaHCO3容易分解为CO2 ，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸,pH值缓冲范围6.8-8.2。对细胞无毒性作用。)能较长时间控制恒定的pH范围。结合NaHCO3使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或

19、观察时难以维持正常的pH值。细胞培养基的基本要求(4)气体及pH：造成pH波动主要是代谢产生的CO2 ，在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2 缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2 及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度 (5)，与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。 大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色 培养基天然培养基： 指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基， 如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。n但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大， 因

20、此逐渐为合成培养基所替代。n目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。n血清(serum)：动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要 甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清 是最为广泛的，所以血清是医药生物技术产品中重要 的原材料之一。 血清种类：目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。n牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。n选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多

21、数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。n 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)取自剖腹产的胎牛； 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛； 小牛血清(calf serum,CS)取自出生10-30天的小牛。n 显然，胎牛血清是品质最高的， 因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、 补体等对细胞有害的成分最少。 血清的主要成分：n血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。n血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化

22、合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。提供激素和各种生长因子： 胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松,地塞米松)、类固醇激素(雌二醇,睾酮,孕酮)等。 生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 血清主要作用：提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮

23、细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。可使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。 血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3，硒等。 血清主要作用： 血清的使用与储存n使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即5630min。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。n储存条件：血清一般储存于-20，同时应避免反复

24、冻融。购买大包装的血清后，首先要灭活处理，然后分装成 小包装，储存于-20，使用前融化。融化时最好现置于4。融化后的血清在4不宜长时间存放，应尽快使用。n使用浓度：自从有了合成培养基，血清就是作为一种 添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为 5-20，最常用是10。过多血清容易使培养中的细胞 发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长 之后容易发生恶性转化。 培养基-合成培养基：n基本组分-四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、 碳水化合物。 无机盐：CaCl2,KCl,MgSO4,NaCl,NaHCO3,NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。氨基酸

25、：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方，是一种理想的培养基。 培养基-合成培养基：谷氨酰胺具有特殊的作用，它能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成1-磷酸腺苷,2-磷酸腺甘和3-磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。需注意，谷氨酰胺在

26、溶液中很不稳定，故4下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20冰箱中保存，使用前加入培养液中。 维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A,D,E,K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12等。维生素C也是不可缺少的，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。碳水化合物：是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时，几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。 培养基-无血清培养基 无血清培养基(s

27、erum free medium,SFM) 是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。n用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。n应用：如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除 其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子； 又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、 生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得 它们的分泌产物

28、。n 无血清培养基的基本配方:基础培养基和添加组分添加组分包括： 促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。 促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。n无血清培养基的基本配方：基础培养基和添加组分 酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。

29、结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 微量元素：硒是最常见的。 n 无血清培养基的使用方法:目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特

30、性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 细胞培养用液 n(1) 平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是 维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。n配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。 细胞培养用液 n(2) 消化液：取材进行原代培养时常常需要将组织块消化 解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁细胞从

31、瓶壁 上消化下来。胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见 有1:125和1:250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。 组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时 要用不含Ca2+ 、Mg2+及血清的平衡盐溶液，因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右，充分溶解，过滤除菌。过滤后可再调至pH7.5，也可不调。(2) 消化液：EDTA溶液：EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，

32、配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+ 、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。(3) pH调整液:n常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。NaHCO3溶液： NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5% CO2的环境下pH达到设计标准。如果是封闭式培养，即不与5%CO2的环境发生交换达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书

33、所要求加入NaHCO3 。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液调节培养基，使之达到所要求的pH环境。HEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。(4) 抗生素:n常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。 青霉素主要是对革兰阳性菌有效， 链霉素主要对革兰阴性菌有效。 加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。n通常使用青霉素终浓度0.007-0.008g/

34、100ml, 链霉素终浓度0.01g/100ml。 一般配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。 (5) 谷氨酰胺补充液:n谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。n谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制时应加温30，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于 -20。使用时，在每100ml培养液中加入0.52ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为14mmol/L。 (6) 二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）nL-谷氨

35、酰胺是大部分细胞培养基的基本成分，是一种 不稳定的氨基酸，在中性的水溶液中会自发降解； 需要频繁地补加L-谷氨酰胺。n二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解，可高压灭菌,释放毒性氨最少。n二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶水解，产生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同样有效地被利用。n二肽谷氨酰胺是最优替代物，它无需适应；既可用于贴壁细胞培养，也适合于悬浮细胞的培养。 (三) 细胞传代方法游离期(10min-4h)贴壁期(10min-4h)潜伏期(6-42h,无细胞分裂)对数生长期(数量增长很快,活力最佳)平台期(接触抑制,密度依赖性)根据细胞生长的恃点，

36、传代方法有3种： 悬浮生长细胞传代n离心法传代：离心1000r/min去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除 l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 半悬浮生长细胞传代n此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接 吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代n采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。(三) 细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 悬浮生长细胞传代n离心法传代：离心1000r/min去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去

37、除 l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 半悬浮生长细胞传代n此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接 吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代n采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。(三) 细胞传代方法n1 吸光培养瓶中的培养液n2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）。静置2-10 min（显微镜下动态监测）。n3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。n4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。n5 离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。n5 吸取1/10-1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。n

38、6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。n7 将后者放入培养箱中培养。贴壁生长细胞传代方法：n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。n在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞， 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解 分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的 细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 细胞活力测定 (1) 台盼蓝法方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2-3min； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力； 原理：死细胞能被台盼兰染上色，