第一章-植物组织培养实验室的构建与操作技术

1、第二章第二章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室 的构建与操作技术的构建与操作技术 主要内容主要内容 组织培养实验仪器设备及使用方法组织培养实验仪器设备及使用方法 培养基的制备方法和步骤培养基的制备方法和步骤 外植体的灭菌方法外植体的灭菌方法 无菌操作技术无菌操作技术 褐变和玻璃化原因及应对措施褐变和玻璃化原因及应对措施 实验室设计原则实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。 实验室的大小应取决于工作的目的和规模实验室的大小应取决于工作的目的和规模 按按组织培养流程组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱起日后工作混乱 利用一定的设备、

2、器材和特殊的实验室结构设计，利用一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件达到严格无菌的条件第一节植物组织培养实验室及主要设备第一节植物组织培养实验室及主要设备一、实验室设计与设备一、实验室设计与设备外植体外植体愈伤组织愈伤组织不定芽不定芽生根生根再生植株再生植株容器具洗涤，物质准备容器具洗涤，物质准备配置培养基并灭菌配置培养基并灭菌外外植体消毒与无菌操作接种植体消毒与无菌操作接种观察、记录、处理观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代）（脱分化、再分化、继代） 再生植株再生植株标准标准的组培实验室的组培实验室洗涤室、准备室、无菌室、培养室、观察室洗涤室、准备室、无菌室、培养室、

3、观察室等等基本基本组培实验室组培实验室准备室准备室（含配药室）、（含配药室）、缓冲间缓冲间、无菌操作室无菌操作室、培养室培养室 功能：功能：进行一切与实验有关的准备工作进行一切与实验有关的准备工作 器皿洗涤、药品的配制器皿洗涤、药品的配制 培养基配制与分装培养基配制与分装 培养基和培养器皿的灭菌培养基和培养器皿的灭菌 培养材料的预处理等培养材料的预处理等 要求：要求： 明亮、通风明亮、通风 便于多人同时工作便于多人同时工作 地面应便于清洁，并应进行防滑处理地面应便于清洁，并应进行防滑处理1、准备室（化学实验室）、准备室（化学实验室）(1)(1)工作台工作台(2)(2)药品柜药品柜(3)(3)冰

4、箱冰箱 普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。等。(4)(4)天平天平 感量感量0.001g的分析天平、感量的分析天平、感量0.0001g的电子的电子天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）、感量为实验用品）、感量为0.1g的的托盘天平（用于称取托盘天平（用于称取用量较大的糖和琼脂等）用量较大的糖和琼脂等） 放置在水平、干燥、不受震动的操作台上放置在水平、干燥、不受震动的操作台上(5)(5)恒温水浴锅恒温水浴锅(6)(6

5、)蒸馏水发生器蒸馏水发生器 蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实验可以用自来水代替蒸馏水）验可以用自来水代替蒸馏水）(7)(7)电炉电炉(8)(8)高压灭菌锅高压灭菌锅 进行培养基、水和器械用具的灭菌进行培养基、水和器械用具的灭菌不锈钢蒸馏水器（单蒸水）不锈钢蒸馏水器（单蒸水）(9)(9)酸度计酸度计 测定培养基及酶制剂的测定培养基及酶制剂的pHpH值（普通实验值（普通实验可使可使用用pHpH试纸）试纸）(10)(10)烘箱烘箱 干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌 和测定干物重和测定干物重(11)(11)摇床摇床 振荡培养振

6、荡培养(12)(12)离心机离心机 分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体生质体PHS-802中文台式酸度计中文台式酸度计通用型或经济型酸度计通用型或经济型酸度计全温型恒温培养摇床全温型恒温培养摇床多振幅高速轨道摇床多振幅高速轨道摇床、缓冲室缓冲室（注意门的朝向）（注意门的朝向） 工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩 功能功能 减少人体从外界带入的尘埃等污染物。减少人体从外界带入的尘埃等污染物。 要求要求 缓冲间需缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌；平方米，应保持清洁无菌； 有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作

7、服；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服； 1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。、无菌操作室（接种室）、无菌操作室（接种室）功能功能 外植体消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原外植体消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备等生质体的制备等要求要求环境干爽，清洁，居于上风位环境干爽，清洁，居于上风位 空间宜小不宜大空间宜小不宜大地面、天花板及四壁密闭光滑，无卫生死角地面、天花板及四壁密闭光滑，无卫生死角室内物品越少越好，尽可能减少空气流动室内物品越少越好，尽可能减少空气流动维护方法维护方法定期消毒（紫外线照射、气雾熏蒸、药品喷

8、洒）定期消毒（紫外线照射、气雾熏蒸、药品喷洒）及时维护（干燥、洁净）及时维护（干燥、洁净） 接种箱接种箱 主体为玻璃箱罩、入口有袖罩主体为玻璃箱罩、入口有袖罩 超净工作台超净工作台 操作台面半开放，方便、操作舒适；通过过滤的空气连续不断吹出，大操作台面半开放，方便、操作舒适；通过过滤的空气连续不断吹出，大于于0.03um0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留直径的微生物很难在工作台的操作空间停留 解剖镜解剖镜 分离微茎尖、转基因等分离微茎尖、转基因等 无菌操作用的器具无菌操作用的器具 酒精灯、镊子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培养瓶，刀剪架等酒精灯、镊子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培养瓶

9、，刀剪架等、培养室、培养室 功能功能 接种的材料进行培养生长的场所接种的材料进行培养生长的场所（其设计以充分（其设计以充分利用空间和节省能源为原则）。利用空间和节省能源为原则）。 要求：要求： 能控制光照和温度能控制光照和温度 保持相对的无菌环境保持相对的无菌环境 有排风窗和换气扇等培养室的换气装置有排风窗和换气扇等培养室的换气装置 有适宜的培养架，日光灯照明。有适宜的培养架，日光灯照明。 主要设备主要设备 培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭氧发生器等。氧发生器等。小型臭氧发生器小型臭氧发生器二、培养器皿及用具二、培养器皿及用具1 1、培养器皿

10、、培养器皿（包括（包括玻璃玻璃器皿和器皿和塑料塑料器皿）器皿） 各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。2 2、微孔过滤器、微孔过滤器（细菌过滤器）（细菌过滤器） 0.450.45微米，抽滤灭菌用，如激素微米，抽滤灭菌用，如激素3 3、器械用具、器械用具 镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。思考题思考题 1 1、一个正规的组织培养实验室应具备哪、一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间？些房间？ 2 2、组织培养常用的设备有哪些？各有何、组织培养常用的设备有哪些？各有何用途？用途？第二节培养基及其配制第二节培养基及其配制

11、定义：定义： 培养基培养基(culture medium)(culture medium)根据植物生长所根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作人工制作的营养的营养物质。是植物组织培养的物质。是植物组织培养的重要基质重要基质。不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同部位的组织对营养的要求也不相同没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官找到一合适的培养基，是培养成功的基础。找到一合适的培养基，是培养成功的基

12、础。一培养基成分一培养基成分主要为：主要为： 水水无机盐无机盐有机化合物有机化合物生长调节物质生长调节物质培养体的支持材料培养体的支持材料水水水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的的介质和溶媒介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的，是生命活动过程中不可缺少的物质。物质。培养基大部分是水（培养基大部分是水（固体培养基固体培养基 约约757580%80%）天然水或自来水天然水或自来水不能不能直接用于直接用于培养基配制培养基配制原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用应用双蒸水或超纯水双蒸水或超纯水。大批量快速繁

13、殖培养，可用单蒸水或纯净水。大批量快速繁殖培养，可用单蒸水或纯净水。 保持母液及培养基成保持母液及培养基成分的精确性分的精确性防止贮藏过程发霉变防止贮藏过程发霉变质质无机盐类无机盐类(inorganic element(inorganic element）离体组织生长发育的基本成分，根据离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为：植物对必需元素需要的量，可以分为：大量元素大量元素微量元素微量元素大量元素大量元素指植物所需元素的浓度指植物所需元素的浓度大于大于0.5mmolL的元素，的元素，有有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。除除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定

14、浓度的外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收中以离子态被吸收N有有硝态氮硝态氮KNO3和和铵态氮铵态氮(NH4)2SO4两种形式（两种形式（一一般般NH4NNH4N对植物生长较为有利对植物生长较为有利）。）。 微量元素微量元素 浓度小于浓度小于0.5mmol0.5mmolL L的元素，有的元素，有 FeFe、CuCu、ZnZn等。等。 铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。到胚的发育，阻碍子叶变绿。3.3.有机化合物有机化合物(organ

15、ic compound) 基本基本培养基（培养基（只含有大量和微量元素）只含有大量和微量元素） 为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等等（）糖类（碳水化合物（）糖类（碳水化合物 ）碳源，维持培养基的渗透压在碳源，维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。多使。多使用用蔗糖蔗糖。 不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚，幼胚培养培养4-6%，某些特殊培养中用，某些特殊培养中用8-10%。 细胞和原生质体培养

16、还用麦芽糖、葡萄糖、果糖细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖（）维生素（）维生素明显的明显的促进促进离体培养物的离体培养物的生长生长。 盐酸硫胺素盐酸硫胺素- -VB1VB1、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醇- -VB6VB6、烟酸、生物素、抗、烟酸、生物素、抗坏血酸坏血酸- -VcVc等。等。 一般用量为一般用量为0.10.11.0mg1.0mgL L。（）肌醇（）肌醇（环己六醇）（环己六醇）促进促进胚状体和芽的形成胚状体和芽的形成。用量一般。用量一般50-100mg/L50-100mg/L。（）氨基酸（）氨基酸常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪

17、蛋白、水解乳蛋白）蛋白） 用量在用量在10-1000mg10-1000mgL L之间。之间。 （营养丰富，极易引起污染营养丰富，极易引起污染，如在培养中无特别需要，以不用为宜。），如在培养中无特别需要，以不用为宜。） （）（） 天然复合物（包括部分蛋白质水解物）天然复合物（包括部分蛋白质水解物）其其成分比较复杂成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。酶等一些复杂化合物。 对细胞和组织的对细胞和组织的增殖与分化增殖与分化有明显的促进有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。作用，但对器官的分化作用不明显。 成分大多不清楚，一般尽量避免使用。成分大多不清楚，一

18、般尽量避免使用。 椰乳椰乳 使用最多、效果最大。用量为使用最多、效果最大。用量为10%20%（愈伤、细胞培养）。（愈伤、细胞培养）。 香蕉汁香蕉汁 用量为用量为150-200mlL，缓冲，缓冲pH值（兰花组培）。值（兰花组培）。 马铃薯马铃薯 用量为用量为150200gL，缓冲，缓冲pH值。值。 其他其他 酵母提取液、麦芽提取液、苹果和番茄的果汁等。遇热较稳酵母提取液、麦芽提取液、苹果和番茄的果汁等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。定，大多在培养困难时使用，有时有效。 、生长调节物质（植物激素）、生长调节物质（植物激素） 植物激素（植物激素（hormonehormone）是植物新陈

19、代谢中）是植物新陈代谢中产生的天然化合物，能以产生的天然化合物，能以极微小的量极微小的量影响到影响到植物的细胞植物的细胞分化、分裂、发育分化、分裂、发育，影响到植物，影响到植物的的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老老和和休眠休眠以及以及萌发萌发等多种生理生化活动，是等多种生理生化活动，是培养基的培养基的关键物质关键物质。 主要包括：主要包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素生长素、细胞分裂素、赤霉素生长素生长素0.05-5mgL细胞分裂素细胞分裂素0.0510mgL。（）生长素类（）生长素类(auxin) u生长素主要被用于生长素主要被用于诱导愈伤诱导愈伤组织

20、形成，促进细胞组织形成，促进细胞脱脱分化分化，诱导根诱导根的分化和的分化和促进促进细胞细胞伸长伸长生长。生长。u天然天然的生长素的生长素热稳定性差热稳定性差，高温高压或受光条件易被破，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用用人工合成人工合成的生长素类物质的生长素类物质u常用常用IAAIAA、IBAIBA、NAANAA、2,4-D2,4-Du配成配成1mg/ml1mg/ml的溶液贮于冰箱中的溶液贮于冰箱中 IAA-IAA-天然生长素，亦可人工合成，其天然生长素，亦可人工合成，其活力较低活力较低，是生，是生长素中活

21、力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，受光也易分解温高压易被破坏，受光也易分解 NAA-NAA-启动能力比启动能力比IAAIAA高出高出3-43-4倍，可大批量人工合成，倍，可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，应用较耐高温高压，不易被分解破坏，应用较普遍普遍 IBA-IBA-促进促进发根发根能力较强能力较强 NAANAA和和IBAIBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。芽的增殖和生长。 2 2，4 4D -D -启动能力比启动能力比IAAIAA高高1010倍，特别是倍，

22、特别是促进愈伤促进愈伤组组织的形成，同时强烈织的形成，同时强烈抑制芽抑制芽的形成，影响器官的发育。的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应毒效应腺嘌吟的衍生物，包括腺嘌吟的衍生物，包括6-BA6-BA、KtKt、Zt Zt 等。其中等。其中ZtZt活性最强，但非常昂贵，常用的是活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA6-BA。作用：作用： 诱导诱导芽芽的分化的分化 促进促进侧芽侧芽萌发生长萌发生长 促进细胞促进细胞分裂与扩大（茎增粗）分裂与扩大（茎增粗），抑制根的分化，抑制根的分化，延缓衰老延缓衰老多用于诱导不定芽的分化、芽的增殖。多用于诱导不定

23、芽的分化、芽的增殖。 （）细胞分裂素类（）细胞分裂素类(cytokinin(cytokinin，CTK)CTK)（）（）赤霉素赤霉素（gibberellic acid）n 有有2020多种，培养基中添加的是多种，培养基中添加的是GAGA3 3，一般极少使用一般极少使用n 作用作用n促进幼苗促进幼苗茎的伸长茎的伸长生长生长n促进促进胚发育胚发育成小植株；成小植株；n离体培养下，还与离体培养下，还与生长素生长素协调作用对协调作用对形成层分化形成层分化有影响有影响n当当生长素生长素赤霉素比值赤霉素比值高高，木质部分化木质部分化，比值低，韧皮部分化。，比值低，韧皮部分化。n打破休眠打破休眠，促进种子、

24、块茎、鳞茎等提前萌发。，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。n 在器官形成后，添加赤霉素在器官形成后，添加赤霉素有时有时可促进器官或胚状体可促进器官或胚状体的生长的生长激素配比模式激素配比模式 生长素生长素/ /细胞分裂素的比值决定分化发育的方向，细胞分裂素的比值决定分化发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。是愈伤组织、长根还是长芽。生长素生长素/ /细胞分裂素细胞分裂素高高 利于根、愈伤组织的形成利于根、愈伤组织的形成适中适中 利于根芽的分化利于根芽的分化低低 有利于芽的形成有利于芽的形成 生长素与细胞分裂素同时使用有生长素与细胞分裂素同时使用有协调协调作用。同时其在作用。同时其在培养基中的培养

25、基中的绝对值绝对值也会影响外植体分化发育的方向。也会影响外植体分化发育的方向。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant.

26、No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet No 6-BA 6-BA re

27、duced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roo

28、ts and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explantNAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced t

29、o 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.其它附加成分其它附加成分（）（）琼脂琼脂(agar) 是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。组织培养中最常用作凝本身并不提供任何营养。组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物，常用固剂，是最方便、最

30、好的凝固剂和支持物，常用量量6-10gL ，不是培养基必需成分。，不是培养基必需成分。（）活性炭（）活性炭(active carbon) 常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质，有利于培养物培养过程中产生的一些有毒物质，有利于培养物的生长。常用浓度的生长。常用浓度0.5%左右，其吸附作用选择性左右，其吸附作用选择性较差，常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸较差，常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。附能力降低甚至解吸附。 二、常用培养基的种类、配方及特点二、常用培养基的种类、配方及特点、培养基种类、培养基种类

31、 根据作用分：根据作用分：诱导诱导培养基：诱导外植体启动生长。培养基：诱导外植体启动生长。增殖增殖培养基：诱导离体培养苗扩大繁殖。培养基：诱导离体培养苗扩大繁殖。生根生根培养基：诱导离体培养苗生根。培养基：诱导离体培养苗生根。 根据营养水平分：根据营养水平分：基本基本培养基：包含无机盐等基本营养成分。培养基：包含无机盐等基本营养成分。完全完全培养基：包含使植物离体生长全面营养。培养基：包含使植物离体生长全面营养。培养基的种类培养基的种类16811681，出现由无机盐组成的，出现由无机盐组成的SacksSacks和和KnopKnop溶液溶液，至，至今仍在作为基本的无机盐培养基今仍在作为基本的无机

32、盐培养基4040年代多用年代多用WhiteWhite培养基培养基6060年代至今大多采用年代至今大多采用MSMS等高浓度培养基等高浓度培养基（可以保证培可以保证培养材料对营养的需要，由于浓度高，在配制、消毒过程中某养材料对营养的需要，由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡） 培养基的名称，多以发明人的名字来命名，也培养基的名称，多以发明人的名字来命名，也有对某些成分进行改良称作有对某些成分进行改良称作改良改良培养基。培养基。 MSMS培养基培养基 无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基为高。无机盐和离子浓度较高

33、，硝酸盐含量较其他培养基为高。 B B5 5培养基培养基 含有较低的铵，双子叶植物特别是木本植物许多都适于用含有较低的铵，双子叶植物特别是木本植物许多都适于用B B5 5。 WhiteWhite培养基培养基 19631963年又作了改良，称作年又作了改良，称作WhiteWhite改良培养基。无机机盐数量较改良培养基。无机机盐数量较低，适于生根培养。低，适于生根培养。 N N6 6培养基培养基 成分较简单，成分较简单，KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量高。广泛应用于小麦、含量高。广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。水稻及其他植物的花药培养和其他

34、组织培养。 KMKM8P8P培养基培养基 有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。原生质融合的培养。 三、培养基的配制三、培养基的配制、母液的配制和保存、母液的配制和保存 母液是欲配制液的母液是欲配制液的浓缩液浓缩液 保证各物质保证各物质成分的准确性成分的准确性，减少微量元素用减少微量元素用药称量误差药称量误差 配制时能配制时能快速移取，快速移取，减少称药麻烦减少称药麻烦 便于低温保藏。便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-100倍。倍。注意事项注意事项 浓度高耐贮存，但准确度低；浓

35、度过低不耐贮浓度高耐贮存，但准确度低；浓度过低不耐贮 避免不恰当混合引起沉淀避免不恰当混合引起沉淀 母液保存在母液保存在5 5冰箱中，出现沉淀、霉变的不能冰箱中，出现沉淀、霉变的不能使用使用 母液浓缩倍数母液浓缩倍数= =（称取药物的量（称取药物的量1000ml1000ml）/ /（每升培养基需药物量（每升培养基需药物量母液体积）母液体积）（）大量元素（）大量元素 可以混在一起配制成可以混在一起配制成10100倍倍液（常用液（常用5050倍）倍） 高浓度高浓度的的Ca2+和和Mg2+会与磷酸盐混合，产生不会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，应单独配制溶性沉淀，应单独配制/ /或者单独配制或者单独配

36、制CaClCaCl2 2 也可也可（）微量元素（）微量元素可配成可配成50-1000倍（常用倍（常用100、200倍）倍）混合母液，混合母液，KI可单独配。可单独配。（）铁盐（）铁盐硫酸亚铁硫酸亚铁和和EDTA钠盐钠盐易沉淀，需单独易沉淀，需单独配制，配成配制，配成100200倍倍鳌合剂鳌合剂不易沉淀。不易沉淀。（）有机化合物（）有机化合物维生素、肌醇、氨基酸等一起配成维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100100或或200200倍液，也可分别配制。倍液，也可分别配制。（）激素（）激素 每种单独配成母液储于冰箱，浓度一般为每种单独配成母液储于冰箱，浓度一般为0.51mg/ml。一般一次只配。一般一

37、次只配50ml或或100ml。 激素难溶于水，配制母液时用激素难溶于水，配制母液时用95%酒精酒精或或 1NHCl，1NNaOH溶解后再定容。溶解后再定容。 生长素类用生长素类用NaOH、细胞分裂素用、细胞分裂素用HCl溶解溶解（6）有机附加物）有机附加物椰乳椰乳 液体胚乳（纱布液体胚乳（纱布滤渣滤渣）-80水浴滤液（水浴滤液（20分钟）分钟）-过滤过滤（去蛋白）（去蛋白）-高温高压灭菌高温高压灭菌-冰箱保冰箱保存存酵母提取液酵母提取液 酵母粉（加水煮沸酵母粉（加水煮沸30分钟）分钟）-过滤去渣过滤去渣-消毒消毒、培养基的配制及灭菌、培养基的配制及灭菌取适量蒸馏水放入容器将母液取出混合取适量蒸

38、馏水放入容器将母液取出混合将琼脂和糖加入容器将琼脂和糖加入容器蒸馏水定容至蒸馏水定容至所需体积所需体积调整调整p分装培养瓶分装培养瓶湿热灭菌法，灭菌湿热灭菌法，灭菌1520min某些遇热不稳定的物质如某些遇热不稳定的物质如IAA、ZT等进行过（抽）等进行过（抽）滤灭菌滤灭菌第三节外植体的选择与培养第三节外植体的选择与培养 植物细胞组织培养的成败除与培养植物细胞组织培养的成败除与培养基的组分有关外，另一个重要因素就是基的组分有关外，另一个重要因素就是外植体本身，为了使外植体适于在离体外植体本身，为了使外植体适于在离体培养条件下生长，使组织培养工作顺利培养条件下生长，使组织培养工作顺利进行，有必要

39、对外植体进行选择与处理。进行，有必要对外植体进行选择与处理。一、外植体的选择一、外植体的选择有有代表性代表性的主要植物的主要植物优良优良的种质、的种质、特殊特殊的基因型的基因型 在植株生长的最适时期取材（花药培养在在植株生长的最适时期取材（花药培养在单核期单核期取材）取材） 大小一般在大小一般在0.5-1.0cm0.5-1.0cm之间（胚胎培养或脱毒在之间（胚胎培养或脱毒在0.5cm0.5cm以下），材料太大易污染，材料太小难于成活。以下），材料太大易污染，材料太小难于成活。 从从生长健壮生长健壮的的无病虫害无病虫害的植株上选取的植株上选取发育正常发育正常的器官的器官和组织。和组织。最好采用茎

40、尖最好采用茎尖，后代性状较稳定，携带细菌，后代性状较稳定，携带细菌较少。较少。 二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌外植体选取外植体选取 流水冲洗流水冲洗 （转入超净工作（转入超净工作台）台）70%酒精表面消毒酒精表面消毒2060s 无菌水冲洗无菌水冲洗 消毒剂消毒剂处理处理 无菌水充分洗净备无菌水充分洗净备用用三、外植体的接种（无菌操作）三、外植体的接种（无菌操作）外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。的全部操作过程。整个过程均需无菌操作。整个

41、过程均需无菌操作。（1 1）借助）借助接种用工具接种用工具将材料将材料切割切割分离。分离。（2 2）将培养基放入超净工作台内，）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培火焰灼烧培养基瓶口养基瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜斜角角，避免灰尘杂菌落入瓶中。，避免灰尘杂菌落入瓶中。（3 3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。（4 4）工具用后应及时灭菌，避免）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染交叉污染。（5 5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。）工作人员操作时禁止不必要

42、的谈话。四、外植体的培养四、外植体的培养 主要因素：主要因素：光照、温度、湿度、氧气光照、温度、湿度、氧气、光照、光照光照强度、光质以及光照时间，对细胞光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用要求外，一般都采用日光灯日光灯作光源，光照强作光源，光照强度度1000-5000Lx，根据不同植物或器官需要，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照可以每天连续光照12-16小时小时，也可每天光照，也可每天光照16小时，小时，8小时黑暗。小时黑暗。、温度、温度大所数植物最适温度在大所数植物最适温度在23-32之间。培

43、养之间。培养室温度是室温度是252。、湿度、湿度培养瓶内相对湿度常是培养瓶内相对湿度常是100%，培养室一般要求相对湿度保持，培养室一般要求相对湿度保持在在70-80%，相对湿度，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿湿。、氧气、氧气接种时要有部分组织和空气接触。接种时要有部分组织和空气接触。振荡培养振荡培养是解决通气的良好是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生

44、长，要选择通气性好的培养瓶盖通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂。，有利于外植体外层细胞开始分裂。、 pH值值不同的植物对培养基最适不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，值的要求也是不同的，大多在大多在56.5左右，一般培养基皆要求左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的这基本能适应大多植物培养的需要。需要。五、外植体的成苗途径五、外植体的成苗途径外植体的成苗途径有三种：外植体的成苗途径有三种：（一）外植体（一）外植体- -愈伤组织愈伤组织- -完整植株完整植株 同时长芽和根同

45、时长芽和根- -植株植株 芽芽- -根根- -植株植株 根根- -芽芽- -植株植株（二）外植体（二）外植体- -胚状体胚状体- -植株植株a)a) 器官上器官上b)b) 愈伤组织愈伤组织c)c) 游离单细胞游离单细胞d)d) 小孢子小孢子 诱导胚状体比诱导芽诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整数量多、速度快、结构完整（三）（三）外植体外植体- -直接形成根与芽直接形成根与芽- -植株植株六、培养中常见问题六、培养中常见问题（ 病原菌病原菌 ：细菌、真菌细菌、真菌细菌细菌污染：菌斑呈污染：菌斑呈黏液状黏液状，接种后，接种后1-2天发现。天发现。 污染途径：外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻

46、底污染途径：外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程操作人员未遵守操作规程 真菌真菌污染：污染部分长有不同颜色的污染：污染部分长有不同颜色的霉菌霉菌，接，接种后种后3-10天天发现。发现。 污染途径：周围环境不清洁；超净工作台过滤装置污染途径：周围环境不清洁；超净工作台过滤装置失效；培养瓶的口径过大失效；培养瓶的口径过大在组织培养过程中培养基在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象致培养失败的现象2 2、污染的预防措施（、污染的预防措施（6 6点）点）（）防止材料带菌的措施（）防止材料带菌的措施 茎尖作外植体时，进行茎尖作外植体时，进行

47、预培养预培养（无糖）或暗培（无糖）或暗培养，以养，以新抽嫩枝新抽嫩枝作外植体。作外植体。 晴天晴天取材，取材，下午下午取材，经日晒可杀死部分细菌取材，经日晒可杀死部分细菌或真菌或真菌 接种时除接种时除去外部韧皮去外部韧皮组织，只接内部的分生组组织，只接内部的分生组织。织。（2）外植体的灭菌）外植体的灭菌 多次多次灭菌法：次氯酸钠灭菌法：次氯酸钠- -无菌水无菌水- -次氯酸钠次氯酸钠 多药剂多药剂交替法：肥皂水交替法：肥皂水- -酒精酒精- -次氯酸钠次氯酸钠- -无菌水无菌水器皿与金属器械的灭菌器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或玻璃器皿可采用湿热灭菌或灭菌灭菌 金属器皿一般金属器

48、皿一般火焰火焰灭菌，灭菌，也可干热灭菌也可干热灭菌（135-140135-140摄氏摄氏度灭菌度灭菌3-5h3-5h；160-170160-170摄氏度灭菌摄氏度灭菌2-4h2-4h；180180-200-200摄氏度摄氏度灭菌灭菌0.5-0.5-1h1h）布质制品的灭菌布质制品的灭菌 湿热灭菌湿热灭菌无菌操作室的灭菌无菌操作室的灭菌 2%新洁尔灭或新洁尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。严格按照无菌操作程序进行严格按照无菌操作程序进行在干燥环境（如在干燥环境（如火焰或干热空气）火焰或干热空气）进行灭菌的技术进

49、行灭菌的技术a.a. 基因型基因型b.b. 外植体的生理状态外植体的生理状态幼年的材料、分生组织含醌类物质较少幼年的材料、分生组织含醌类物质较少c.c. 培养基的成分培养基的成分 无机盐浓度过高无机盐浓度过高 生长调节物质使用不当，生长调节物质使用不当，BABA过多过多 培养条件不适宜，培养条件不适宜，温度过高或光照过强温度过高或光照过强d.d. 材料转移时间材料转移时间时间过长引起材料褐变时间过长引起材料褐变外植体体内的多酚氧化酶被激活，使细胞外植体体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的内的酚类酚类物质氧化成棕褐色的物质氧化成棕褐色的醌类醌类物质，物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐这种致

50、死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。植体的分化，最后变褐死亡的现象。1、影响因素、影响因素选择选择适宜的外植体适宜的外植体及及最佳培养基最佳培养基提高提高转管转管率率加加抗氧化剂抗氧化剂（抗坏血酸、（抗坏血酸、PVP、牛血清白、牛血清白蛋白等）蛋白等）加加活性炭活性炭 0.1-0.5%活性炭活性炭 2、褐变的防止措施、褐变的防止措施l组培苗外观形态呈组培苗外观形态呈 半透明状的生长异常现象半透明状的生长异常现象l叶、嫩梢呈水晶透明或半透明叶、嫩梢呈水晶透明或半透明水浸状水浸状；矮小；矮小肿胀失肿胀

51、失绿绿；叶片皱缩卷曲、；叶片皱缩卷曲、脆弱易碎脆弱易碎l叶表几叶表几无角质层无角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织栏组织，仅有海绵组织l体内体内含水量高含水量高，干物质低，干物质低，光合能力和酶活性降低光合能力和酶活性降低，组织畸形组织畸形，器官功能不全器官功能不全，分化能力降低，分化能力降低l生根困难生根困难，很难继续培养和移栽成活，很难继续培养和移栽成活激素激素：CTKCTK浓度、比例过高（继代次数太多）浓度、比例过高（继代次数太多）琼脂琼脂：琼脂浓度低（培养基太：琼脂浓度低（培养基太“稀稀”）温度温度：低温：低温光照光照时间：光照太多、太

52、强时间：光照太多、太强通风通风条件：气体交换不良条件：气体交换不良(6)离子离子水平：无机离子种类及比例不当水平：无机离子种类及比例不当 提高蔗糖和琼脂浓度（提高提高蔗糖和琼脂浓度（提高渗透势渗透势） 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例 适当增加适当增加Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu，降低，降低NN（铵态氮铵态氮）和）和ClCl（重选或改良培养基配方重选或改良培养基配方） 增加增加自然光照，自然光照，1000-1800lx，控制光照时间，控制光照时间8-12h。 适温适温生长，热击处理生长，热击处理 使用透气性好的封口膜使用透气性

53、好的封口膜 培养基中加入培养基中加入青霉素青霉素、间苯三酚间苯三酚、根皮苷根皮苷或或多效唑多效唑等等一、试管苗的特点一、试管苗的特点1 1、试管苗的生态环境、试管苗的生态环境高、恒温高、恒温 试管苗整个生长过程中采用的是试管苗整个生长过程中采用的是恒温培养，温差很小恒温培养，温差很小。并且温度一般控制在并且温度一般控制在25+2甚至更高。甚至更高。 外界环境条件外界环境条件温度不断变化温度不断变化，其调节由太阳辐射决定，其调节由太阳辐射决定，温差很大（季节、日夜）温差很大（季节、日夜），而且一般不会达到，而且一般不会达到25+2。 组织培养出来的苗通组织培养出来的苗通称试管苗或组培苗称试管苗或组培苗高湿高湿 试管瓶内水分移动途径有两条：试管瓶内水分移动途径有两条：试管苗水分从气孔蒸腾试管苗水分从气孔蒸腾培养基向外蒸发，凝结后又进入培养基培养基向外蒸发，凝结后又进入培养基