生物分离工程(三版)(孙彦)08

1、生物分离工程生物分离工程亲和纯化技术亲和纯化技术总体学习目的和要求总体学习目的和要求 理解生物亲和作用的本质，影理解生物亲和作用的本质，影响因素和作用体系。亲和纯化的原响因素和作用体系。亲和纯化的原理与操作。了解几种常用亲和纯化理与操作。了解几种常用亲和纯化方法。方法。 目录目录n生物亲和作用生物亲和作用n亲和色谱原理亲和色谱原理n亲和亲和色色谱谱介质介质n亲和吸附平衡亲和吸附平衡n亲和亲和色色谱谱的应用的应用n亲和膜亲和膜色色谱谱n其它亲和分离技术其它亲和分离技术生物亲和作用生物亲和作用-学习要点学习要点n识记：识记：生物亲和作用的概念生物亲和作用的概念 n理解：理解：生物亲和作用的本质，影

2、响生物亲和作用的本质，影响亲和作用的因素亲和作用的因素 n应用：应用：了解常用的亲和作用体系了解常用的亲和作用体系 亲和作用的由来亲和作用的由来nAffinity一词源于拉丁语的affinitus，意为结婚或亲缘关系生物亲和作用生物亲和作用-定义定义 生物分子能够区分结构生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生某一种分子相结合。生物分子间的这种特异性物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用相互作用称为亲和作用生物亲和作用生物亲和作用-本质本质n亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用

3、机理尚不清楚尚不清楚n蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构n上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙形成构象上的钥匙- -锁关系锁关系n亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用种力的相互作用亲和作用中的静电作用亲和作用中的静电作用n中性中性pH值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、赖氨半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、赖氨酸和组氨酸等碱性氨基酸带正电荷酸和组氨酸等碱性氨基酸带正电

4、荷nN末端氨基酸末端氨基酸-氨基带正电荷，氨基带正电荷，C末端氨基酸的羧基末端氨基酸的羧基带负电荷带负电荷n近距离上产生强烈的静电引力近距离上产生强烈的静电引力亲和作用中的氢键作用亲和作用中的氢键作用n亲和作用的分子对的一个分子中含有氧原子或氮原亲和作用的分子对的一个分子中含有氧原子或氮原子，结合部位之间形成子，结合部位之间形成O-H-O或或O-H-N的氢键作用的氢键作用n氧和氧或氮和氧原子需与氢原子基本排列在一条直氧和氧或氮和氧原子需与氢原子基本排列在一条直线上，且原子之间的距离达到一定程度线上，且原子之间的距离达到一定程度n氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格氢键的产生与否受结合部

5、位之间的位置关系的严格制约制约亲和作用中的疏水性相互作用亲和作用中的疏水性相互作用 如果亲和作用的分子对的一个分子中含有芳如果亲和作用的分子对的一个分子中含有芳香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用相互作用 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸生物亲和作用生物亲和作用-亲和作用中的相互作用力亲和作用中的相互作用力n静电作用静电作用n氢键氢键n疏水性相互作用疏水性相互作用n配位键配位键n弱共价键弱共价键亲和作用亲和作用静电作用静电作用氢键氢键疏水性相互

6、作用疏水性相互作用配配位位键键弱共价键弱共价键除具备“钥匙”和“锁孔”的关系外，生物亲和作用还需存在特殊的相互作用力，这也是亲和作用特异性高的主要原因生物亲和作用生物亲和作用-影响亲和作用的因素影响亲和作用的因素n离子强度离子强度npHn抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质n温度温度n离液离子离液离子n螯合剂螯合剂离子强度对亲和作用的影响离子强度对亲和作用的影响n亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度会减弱或完全破坏亲和作用；会减弱或完全破坏亲和作用；n提高离子强度也会降低或消除氢键作用；提高离子强度也会降低或消除氢键作用；n当亲和结合作用主要源于疏水性相

7、互作用，当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用，增大离子强度则可提高亲和结合作用；增大离子强度则可提高亲和结合作用；pH值对亲和作用的影响值对亲和作用的影响n作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团，作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团，不同解离基团具有不同的解离常数；不同解离基团具有不同的解离常数；n如果静电引力对亲和结合作用贡献较大，如果静电引力对亲和结合作用贡献较大，pH值会严重影响亲和作用，即适当的值会严重影响亲和作用，即适当的pH值下亲值下亲和结合作用较高，而在其他和结合作用较高，而在其他pH值下亲和结合值下亲和结合作用减弱直至消失；作用减弱直至消失；其它因素对亲和作用的影响其它因素对

8、亲和作用的影响n抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质 如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲和作用。和作用。n温度温度 温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、氢键温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、氢键和配位键；增强疏水性相互作用和配位键；增强疏水性相互作用n离液离子离液离子n螯合剂螯合剂 如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键，加入如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键，加入乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会使亲和作用消失乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会使亲和作用消失常见的亲和作用体系常

9、见的亲和作用体系特异性亲和体系高特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙受体蛋白核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白酶底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白A蛋白、G蛋白酶辅酶凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质氨基酸（组氨酸等）亲和纯化亲和纯化定义 将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性固体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子从混吸附或结合另一种分子，使另一种分子从混合物中得到选择性分离纯化的方法称为亲和合物中得到选

10、择性分离纯化的方法称为亲和纯化。纯化。 在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为亲和结合对象的配基。 亲和分配平衡亲和分配平衡 n在亲和作用体系中，如果用在亲和作用体系中，如果用L L表示配基，表示配基，E E表示蛋白表示蛋白质，则配基和蛋白质之间的结合反应可表示为质，则配基和蛋白质之间的结合反应可表示为n结合常数结合常数eqKLELE LELEdK LELEeqK结合常数越大（或解离常数越小），表示亲和结合作用越强。一般亲和体系的结合常数为104108L/mol，最高可达到1015 L/mol，此时的亲和结合基本上不可逆的。 亲和亲和色色谱谱原理原理-学习要点学习要点n理解：理解

11、：亲和亲和色色谱谱的原理与操作的原理与操作亲和色谱定义 亲和亲和色色谱谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相物质的液相色色谱谱法。法。 亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲和吸附介质（亲和吸附剂）亲和亲和色色谱谱原理原理 亲和亲和色色谱谱操作与一般的固操作与一般的固定床吸附操作方式相似，定床吸附操作方式相似，多采用断通式前端分析多采用断通式前端分析法，分为进料、杂质清法，分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱合层洗、目标产物洗脱合层析柱再生四步。析柱再生四步。亲和亲和色色谱谱原理原理n料液进料（料液进料（feedstock loadingfeedstock loa

12、ding） 含有目标产物的料液连续通入含有目标产物的料液连续通入色色谱谱柱，直至目标产柱，直至目标产物在物在色色谱谱柱出口穿透柱出口穿透n杂质清洗杂质清洗(contaminant washing) (contaminant washing) 利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液，利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液，清洗清洗色色谱谱柱除去不被吸附的杂质；柱除去不被吸附的杂质；n产物洗脱产物洗脱(target product elution) (target product elution) 利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物

13、n柱再生（柱再生（column regeneration)column regeneration) 利用清洗液清洗再生利用清洗液清洗再生色色谱谱柱柱亲和亲和色色谱谱介质学习要点介质学习要点n理解理解：间隔臂的作用，常用亲和配基种类：间隔臂的作用，常用亲和配基种类n应用应用：了解亲和配基的固定方法，应用实：了解亲和配基的固定方法，应用实例以及亲和吸附介质的要求例以及亲和吸附介质的要求亲和配基酶、抗体和蛋白亲和配基酶、抗体和蛋白n酶的抑制剂酶的抑制剂 蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂

14、（结合常布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常数为数为109 L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数为为4104 L/mol）。n抗体抗体 抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107 1012 L/moln蛋白蛋白A（或称（或称A蛋白）蛋白） A蛋白为分子量蛋白为分子量42 kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。它与动物免疫球蛋白胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。）具有很强的结合作用。 亲和配基凝集素和

15、色素亲和配基凝集素和色素n凝集素凝集素 凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的配基。配基。n辅酶和磷酸酰苷辅酶和磷酸酰苷 各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。n三嗪类色素三嗪类色素 这类色素与这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能与脱氢酶、血清白

16、蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生结合作用结合作用亲和配基过渡金属等亲和配基过渡金属等n过渡金属离子过渡金属离子 Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生亲和结合作用。亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与等过渡金属离子与N、O和和S等供电原子等供电原子产生配位键。产生配位键。n组氨酸组氨酸n肝素肝素 肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量为为5到到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用，它与凝血蛋白质、脂

17、蛋白等有亲和作用。 亲和亲和色色谱谱-亲和配基亲和配基亲和亲和色色谱谱-亲和亲和色色谱谱介质应满足条件介质应满足条件n具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；n物理和化学稳定性高，有较高的机械强度物理和化学稳定性高，有较高的机械强度n含有可活化的反应基团含有可活化的反应基团n粒径均一的球形粒子粒径均一的球形粒子亲和亲和色色谱谱-亲和配基固定化亲和配基固定化n亲和配基的固定化方法亲和配基的固定化方法n介质的活化介质的活化介质的活化方法溴化氰法介质的活化方法溴化氰法n溴化氰活化法用于亲和溴化氰活化法用于亲和色色谱谱介质连接含有氨基的配介质连接含有氨基的配基基n最初的

18、溴化氰活化法，需要加入最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至至pH为为11，成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是剧毒试剂，并且具有挥发性。剧毒试剂，并且具有挥发性。n溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非特异性吸附增加等。特异性吸附增加等。介质的活化方法环氧基法介质的活化方法环氧基法n环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性低的特点，是目前广泛采用的制备方法。

19、低的特点，是目前广泛采用的制备方法。n活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和适当浓度的适当浓度的NaOH，然后振荡反应，然后振荡反应2.5h左右。左右。n为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和NaOH的用量，的用量，NaOH的浓度，反应时间都可以根的浓度，反应时间都可以根据具体实验做出调整。据具体实验做出调整。n由于环氧氯丙烷为油相，而由于环氧氯丙烷为油相，而NaOH溶液为水相，为溶液为水相，为了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶剂二甲基亚砜（剂二甲基

20、亚砜（DMSO）。）。 介质的活化方法羰基二亚胺法介质的活化方法羰基二亚胺法亲和亲和色色谱谱-间隔臂的作用间隔臂的作用n当配基分子量较小时，为当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接要在配基和载体之间连接一个一个“间隔臂间隔臂”n间隔臂的长度有一定限制，间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱目标分子的亲和力会减弱亲和亲和色色谱谱-影响亲和吸附的因素影响亲和吸附的因素n杂质的影响杂质的影响 料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降

21、低纯化效果的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关料、配基固定化方法等众多因素相关n料液流速料液流速 流速的增大，分离速度加快，但柱效降低流速的增大，分离速度加快，但柱效降低亲和亲和色色谱谱-目标产物的特异性洗脱目标产物的特异性洗脱 特异性洗脱利用含有与特异性洗脱利用含有与亲和配亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物小分子化合物为洗脱剂，通过与亲为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。脱附目标

22、产物。特异性洗脱条件温特异性洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活和，有利于保护目标产物的生物活性性。另外，由于仅特异性洗脱目标。另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系产物，对于特异性较低的亲和体系或非特异性吸附较为严重的物系，或非特异性吸附较为严重的物系，特异性洗脱有利于提高目标产物的特异性洗脱有利于提高目标产物的纯度纯度。 亲和亲和色色谱谱-目标产物的非特异性洗脱目标产物的非特异性洗脱 非特异性洗脱是提高洗脱液的非特异性洗脱是提高洗脱液的pH值、离子强值、离子强度、离子种类或温度度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是较多采用

23、的洗脱方法。当亲和结合和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不可逆变性，需慎重使用。可逆变性，需慎重使用。亲和膜亲和膜-学习要点学习要点n理解：理解：亲和膜原理和特点亲和膜原理和特点 n应用：应用：了解亲和膜的实际应用了解亲和膜的实际应用 亲和

24、膜亲和膜-定义定义 亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。是固定床亲和层析的变型。亲和膜亲和膜-亲和膜的提出亲和膜的提出n固定床亲和层析的缺陷固定床亲和层析的缺陷 以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）放大困难（放大采用径向放大）n亲和膜思路提出亲和膜思路提出 “降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速”亲和膜亲和膜-亲和膜的原理亲和膜的原理 亲和配基固定在亲和配基固定在

25、膜孔表面，流体在膜孔表面，流体在对流状态下透过膜对流状态下透过膜孔的过程中目标蛋孔的过程中目标蛋白与配基接触而被白与配基接触而被吸附吸附亲和错流过滤亲和错流过滤-学习要点学习要点n理解：亲和错流过滤原理和特点理解：亲和错流过滤原理和特点 n应用：了解亲和错流过滤的实际应用应用：了解亲和错流过滤的实际应用 亲和错流过滤亲和错流过滤-定义定义 亲和错流过滤是生物亲和相互作用亲和错流过滤是生物亲和相互作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术子的分离纯化技术亲和错流过滤亲和错流过滤-原理原理n传统的膜过滤对蛋白质的分离是基于分子量传统的膜过滤对蛋白质的分离是

26、基于分子量大小的差异；分子量相差大小的差异；分子量相差10倍以上的物质可倍以上的物质可得到分离，选择性差；得到分离，选择性差；n将亲和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶将亲和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶性微粒后，目标蛋白质将选择性地吸附于这性微粒后，目标蛋白质将选择性地吸附于这些修饰亲和配基的材料上，从而在目标蛋白些修饰亲和配基的材料上，从而在目标蛋白质与杂蛋白之间形成较大的尺寸差，提高膜质与杂蛋白之间形成较大的尺寸差，提高膜分离选择性分离选择性n目标产物被截留并经洗脱获得纯品目标产物被截留并经洗脱获得纯品亲和错流过滤亲和错流过滤-特点特点n优点优点吸收膜分离的优点，易于放大和连续操作吸收膜分离的优点，易于放大和连续操作吸收亲和吸附高选择性的特点吸收亲和吸附高选择性的特点亲和载体无内扩散阻力，目标分子的亲和结合速度快亲和载体无内扩散阻力，目标分子的亲和结合速度快n缺点缺点一级吸附平衡、一个理论板、效果差一级吸附平衡、一个理论板、效果差其他亲和过程其他亲和过程-学习要点学习要点n理解：理解：上述亲和纯化方法的原理和上述亲和纯化方法的原理和操作操作 n应用：应用：了解上