《生物工艺学下》复习题

1、精选优质文档-倾情为你奉上生物工艺学下复习题1 生物下游加工过程的特点是什么？生物产品特点： 产物浓度低的水溶液 (原因：a 氧传递限制；b 细胞量;c 产物抑制 组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶物;e 化学添加物由于起始浓度低，杂质又多，所以提取步骤多，常导致收率低，成本高。发酵液的产品浓度与价格成反比。P3图13.1. 产物稳定性差(a 化学降解(pH , 温度);b 微生物降解 （酶作用， 染菌）c剪切力（影响空间结构、使分子降解） 由于分批操作和微生物变异，发酵液每批不尽相同，提取方法要有弹性。选择提取方法要考虑放罐时间、杂菌污染、加入添加物等，质量要求高 （药

2、品或食品）2 生物下游加工过程的一般工艺流程和阶段是什么？ 预处理和固液分离技术: 絮凝，离心，过滤，微过滤。 细胞破碎技术: 球磨，高压匀浆，化学破碎技术 初步纯化技术（目的在于浓缩): 盐析法，萃取，有机溶剂沉淀，化学沉淀，大孔吸附树剂，膜分离技术 高度纯化技术(精制）: 各类层析，亲和，疏水，聚焦，离子交换 最后纯化-成品加工 喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥，结晶3 凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成 mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10

3、mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。4 凝聚的机理：1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构3）破坏水化膜5 常用的凝聚剂电解质有硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO4·7H2O ；石灰；ZnSO4；MgCO36 絮凝的机理架桥作用7 工业常用的絮凝剂分为三类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。2）天然有机高分子絮凝剂 天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来

4、源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。3）无机高分子聚合物 有聚合铁系和铝系两大类8 高价无机离子的去除方法1. Ca2+ 草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸） ；2. Mg2+三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；3. Fe2+ 黄血盐，普鲁士兰沉淀9 预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；10 常见的固

5、液分离方法 过滤 filtration离心 Centrifugation 膜分离 membrane separation双水相萃取 ATPS 扩张床吸附 EBA11 错流过滤 又称切向流过滤（Cross-Flow Filtration）传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过滤的机制，即液体的流向和滤膜相切。12 细胞破碎（cell rupture）技术 是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。13 机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超声波破

6、碎法（ultrasonication）14 非机械方法很多（1 酶解（2 化学法溶胞 （3 物理法 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。15 基因工程包涵体的纯化方法收集菌体细胞 细胞破碎 包涵体的洗涤 目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性16 常用包涵体蛋白变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用；表面活性剂如1-2 SDS， 作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。PH>9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。17 包涵体蛋白的复性原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变

7、性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。复性方法：稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析 18 沉淀法的分类 根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等（7）亲和沉淀法（8） 选择性沉淀法。19 盐析 在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。20 盐析法机理（1

8、）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。21 Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系 S=-s S蛋白质的溶解度，g/L; I离子强度， I=1/2mizi2 mi离子 i的摩尔浓度；Zi所带电荷；常数，图中截距Ks盐析常数，图中直线斜

9、率22 和Ks的物理意义代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks盐析常数，代表图中直线的斜率；从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。23 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液；第二种叫分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及

10、温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。24 等电点沉淀法在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀25 有机溶剂沉淀法概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。26 有机溶剂沉淀法机理A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 < D水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，

11、它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。C 相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层27膜分离技术 概念：用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。28常见膜分离方法按分离粒子大小分类：（1 透析（Dialysis，DS） （2 微滤（Microfiltration，MF） （3 超滤（Ultrafiltration，UF） （4 纳滤（Nanofiltration，NF） （5

12、反渗透（Reverse osmosis，RO） （6 电渗析（Electrodialysis，ED）（7 渗透气化（Pervaporation，PV）29对于不同种类的膜材料的基本要求：（1 耐压：膜孔径小，要保持高通量就必须施加较高的压力，一般模操作的压力范围在0.10.5MPa，反渗透膜的压力更高，约为110MPa （2 耐高温:高通量带来的温度升高和清洗的需要 （3 耐酸碱：防止分离过程中，以及清洗过程中的水解； （4 化学相容性：保持膜的稳定性； （5 生物相容性：防止生物大分子的变性； （6 成本低。30 影响截留率的因素： （1 分子形状：线状分子易透过，s线 < s球；（2

13、 吸附作用：溶质吸附于膜孔壁上，降低膜孔有效直径 （3 浓差极化作用：高分子溶质在膜面沉积，使膜阻力­，较小分子溶质的截留率­，分离性能¯。 （4 温度/浓度，T­ C¯，使¯s，因为膜吸附作用¯； （5 错流速度­，¯s，因为浓差极化作用¯； （6 pH、离子强度影响蛋白质分子构型，影响s31 截断分子量:（molecular weight cut-off，MWCO）相当于一定截留率(通常为90或95)的分子量，随厂商而异32 超滤 是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物

14、理筛分过程。其截断分子量一 般为6000到 50万，孔径为几十nm，操作压0.2-0.6MPa。 33 反渗透 利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。操作压差一般为1.510.5MPa，截留组分为小分子物质。34 萃取：当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质（如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。35

15、液液萃取是以分配定律为理论基础 分配定律：一定T、P下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，平衡时，溶质在两相中浓度之比为常数。K=C1/C2=萃取相的溶质浓度/萃余相的溶质浓度K-分配系数 常温常压下，K为常数，应用前提条件：A稀溶液，B溶质对溶剂互溶没有影响，C溶质分子为同一分子类型，不发生缔合或解离36 分离因素 表示有效成分A与杂质B的分离程度。=KA/ KB =1，KA = KB，分离效果不好；>1，KA > KB，分离效果好；越大，KA 越大于KB，分离效果越好。37 弱电解质的表观分配系数弱酸的表观分配系数：K=K0 /(1 10 pH pK )弱碱的表观分配系数： K=

16、K0 /(1 10 pK pH )K0只与T、P有关； K与T、P和pH有关K可通过实验求出，而K0不能，可由公式求出。38 超临界流体萃取 利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料(液体或固体)接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离。39 双水相分配技术 利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混合，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖 40 离子交换树脂的结构 其结构由三部分组成：（1）.不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；（2

17、）.是与骨架相联的功能基团；（3）.是与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进进出出，就发生离子交换现象。活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂， 与阳离子发生交换活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂， 与阴离子发生交换41 离子交换树脂的理化性能 各种离子交换树脂滴定曲线42 离子交换操作方式静态：操作简单、但是分批操作，交换不完全动态：离子交换柱，交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行，亦称为离子交换层析法, 操作连续、交换完全，适宜多组份分离柱式固定床（FixedBed）模拟移动床（SMB）43 吸附 是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附

18、剂表面，而从混合物中的分离的的过程。44 常用的吸附剂 大网格聚合物吸附剂：活性碳：助滤，脱色，去热原。使用:偏酸性(pH 5-7),加热(50-60)。搅拌30min。活性白土：脱组胺类过敏物，脱色。硅藻土：助滤，澄清45 基因不稳定性的原因 分离丢失、结构不稳定性、宿主细胞调节突变 46 工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌的原因：（1 重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢（2 重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。47 甲醇营

19、养型酵母宿主系统的特点1）甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源。因为甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶（Alcohol Oxidase,AOX）二羟丙酮合成酶（Dihydroxy-acetone synthase,DHAS）和过氧化氢酶（Catalase），表达的DHAS的含量甚至可达到总细胞蛋白的60-80%。而当以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时，AOX几乎不表达。进一步研究表明，AOX的表达是转录水平调控的，其启动子能非常有效地控制外源基因的表达。已经在P.pastoris染色体中鉴定了二个AOX基因（AOX1和AOX2），AOX1编码的蛋白质与AOX2编码

20、的蛋白质有97%的同源性，但AOX1基因的启动子（PAOX1）受甲醇强烈诱导，而PAOX2则很弱。H.polymorpha染色体只有一个AOX基因，也受甲醇调节。2）甲醇营养性酵母的另一个特点是甲醇代谢所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体中，形成区域化。在葡萄糖为碳源时，菌体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80%，里面的蛋白质主要AOX和DHAS。48 为了提高外源表达蛋白在酵母细胞中的稳定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下几种方法：一是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，提高给酵母细胞蛋白酶过量的底物，以减

21、少目的蛋白的水解；二是由于P.pastoris能耐受较宽的pH范围（pH3.0-7.0），因此可调培养液pH 值抑制蛋白水解酶活性；三是改造P.pastoris表达宿主菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白稳定。49 由于甲醇营养型酵母表达系统具有一些特殊的优点（1）应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控；（2）表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，适于高密度发酵，产量高；（3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等因此最近十几年来，人们越来越多的应用它作为外源基因表达的系统。50 DNA重组药物制造的主要步骤获得目的基因DNA的体外重组（切与连）载体的选择受体细胞的选择重组DNA分子转

22、化（转）转化子的筛选与鉴定（选）外源基因的大规模表达和分离纯化产品的检验和制剂制备51 Ins的性质（1 MW：5700左右 PI：5.35.35（2 溶解度 Ins在pH 4.56.5范围内几乎不溶于水，在乙醚中不溶，在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶。易溶于稀酸或稀碱溶液，在80%以下乙醇中也可溶解。（3 在溶液中的状态 胰岛素在锌盐在pH 47时，聚合成不溶解状态的沉淀；pH>9时解聚并失活（4 稳定性 Ins在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定 ，还原剂及多种重金属使Ins失活。紫外线、光氧化、超声波会引起Ins变性。52 酸醇提取法提取动物胰岛素53 重组DNA技术制

23、造人胰岛素 1）以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别表达A链和B链，然后再组合起来。2）通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。54 氨基酸的生产方法A、发酵法（1）直接发酵 第一类用野生菌株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸。第二类用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸缺陷型生产赖氨酸；酪氨酸缺陷型生产苯丙氨酸；苯丙氨酸缺陷型生产亮氨酸；亮氨酸缺陷型生产缬氨酸。第三类用抗氨基酸结构类似物突变株，如利用乳糖发酵短杆菌 的S-(2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC,赖氨酸结构类食物）抗性菌株生产

24、赖氨酸。利用黄色短杆菌的5-甲基色氨酸（5-MT，酪氨酸结构类似物）抗性菌株生产酪氨酸。第四类抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株，如利用乳糖发酵短杆菌的抗AEC腺嘌呤、鸟嘌呤缺陷型生产赖氨酸。 营养缺陷型回复突变株发酵。（2）添加前体的发酵：通过添加氨基酸的前体或中间产物，以避免生物合成途径中的反馈抑制，如以吲哚为前体，利用麦角菌生产色氨酸。B、酶法：利用酶来制造氨基酸。应用完整菌体或从微生物细胞抽提的酶类合成氨基酸。天冬氨酸已于1973年应用完整菌体固定化进行生产，这是世界上最早应用固定化菌体的例子。赖氨酸、色氨酸、丙氨酸也可以生产。C、提取法：蛋白质水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪

25、氨酸。D、合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸，蛋氨酸和甘氨酸现在仍大量应用合成法。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。近年来，由于微生物代谢调控理论的研究，使得大部分氨基酸得以发酵生产。55 氨基酸生物合成的代谢互锁：从生物合成途径看，是受一种完全无关的氨基酸的控制。它只是在很高浓度下（与生理学浓度相比）才能体现抑制作用，而且是部分性的抑制（阻遏）作用。56 控制细胞渗透性 代谢产物的细胞透性是氨基酸发酵的重要因素，只有使细胞内的氨基酸渗透到细胞外，才能大量积累氨基酸。（1）生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。

26、（2）青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞内外的渗透压的差异使谷氨酸泄漏出来。57 氨基酸产生菌的定向育种方法解除反馈调节-结构类似物抗性株选育切断支路代谢营养缺陷型的选育优先合成的转换渗漏缺陷型的选育选育温度敏感突变株改变细胞膜的通透性 把合成的氨基酸尽快排出细胞外，预防反馈抑制，大量合成氨基酸。如生物素缺陷型、油酸缺陷型和甘油缺陷型58 Glu发酵常用菌种 谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum) 北京棒杆菌(C.peiking AS.1229) 黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) 乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)59 -酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体

27、。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸60 在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸 ，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环61 如何控制生物素添加量使菌种生产Glu 高浓度bio增强羧化酶活性，促进羧化反应利于Glu合成。低浓度bio降低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向Glu合成，低浓度bio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于Glu胞外分泌，解除反馈调节，利于Glu合成并大量积累。添加亚适量，5-10g/L 培养基，生产Glu62 Hse-, AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型双突变株，不论添加Hs

28、e浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协同反馈抑制，大量积累Lys63 发酵法生产天冬酰胺酶发酵法生产-以大肠杆菌发酵生产。大肠杆菌种子级菌种加入玉米浆，发酵罐、37下培养7小时取发酵液，加入丙酮后压滤滤饼风干，得干菌体加入硼酸缓冲液，PH=8、37下提取得提取液，加醋酸调节PH=4。3，得沉淀物，即为干粗酶加入甘氨酸，60热处理30分钟得酶溶液，加入聚乙二醇，在不同的PH值下进行精制得无热源酶液冻干、无菌分装得天门冬酰胺酶冻干制剂64 维生素B2（vitamin B2）的生产菌种 菌种很多，主要是棉病囊霉和阿氏假囊酵母65 VC工艺路线；两步法第一步：发酵山梨醇制备山梨糖菌种：醋酸杆菌发酵条件：温度26-30度，PH4.4-6.8