麻疯树curcin 启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析

1、植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 407414, .研究论文.麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析秦小波, 高继海, 徐莺*, 张金平, 邵彩霞, 林莎, 张淑文, 江璐玎, 李月琴, 陈放四川大学生命科学学院, 成都 610064摘要 核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白(curcin)前体基因编码麻疯树胚乳I 型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5侧翼区0.6 kb长的片段, 将该片段插入pBI121载体置换其中的CaMV 35S启动子并在相应的转

2、基因烟草中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现, 该0.6 kb长的片段能够启动报告基因在种子中的表达, 并且其在种子不同发育阶段的表达活性存在差异。同时, GUS组织化学染色定位分析表明, 在双子叶植物中该启动子片段是胚乳特异性表达的, 它从心形胚时期开始持续地在烟草的胚乳中发挥启动活性。关键词 curcin, 麻疯树, 启动子, 核糖体失活蛋白秦小波, 高继海, 徐莺, 张金平, 邵彩霞, 林莎, 张淑文, 江璐玎, 李月琴, 陈放 (2008). 麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析. 植物学通报 25, 407414.在植物发育和遗传工程中,

3、研究者总是希望目的基因在特殊的组织和器官里能够达到期望的表达水平。基因的不同表达模式, 例如组织和器官的特异性、植物发育中的独立性等, 在植物的生长发育中非常重要。由于分子调控元件是建立生物反应器所需要考虑的一个重要前提, 因此研究植物中能够调控外源基因表达的分子元件非常必要, 而启动子正是其中一种重要的类型(McElroy and Brettell, 1994)。在植物中, 核糖体失活蛋白具有十分重要的生物学功能。麻疯树毒蛋白(curcin)作为一种核糖体失活蛋白,主要贮存在含油植物麻疯树种子的胚乳中(王小行等,2006), 并且含量很高(Mourgue et al., 1961)。它具有和

4、巴豆毒蛋白(crotin)相似的动物毒性和蛋白质合成抑制能力(Stirpe et al., 1976), 其半抑制系数仅略低于美洲商陆蛋白(Barbieri et al., 1993)。许多研究表明该类蛋白可能具有多种生物学功能, 如参与植物的防御体系等(Barbieri et al., 1993; Stirpe, 2004)。因此, 研究它的表达模式将有助于其在医药上的开发应用。启动子是调控基因表达的一项重要因素, 是帮助基因在恰当的时间和地点实现功能的前提之一。目前, 本实验室已克隆得到编码一种curcin蛋白的基因序列(Lin et al., 2003),但对该基因的表达模式尚未开展研究

5、, 同时在以往有关核糖体失活蛋白研究的报道中也未发现对其启动子的相关研究。因此, 本研究针对curcin基因5上游长度为620 bp的序列进行分析研究, 通过生物信息学和转基因的方法鉴定了该片段的启动子活性及其强度和组织特异性, 为进一步了解curcin在麻疯树生长发育中的作用以及构建胚乳特异型基因工程载体奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料麻疯树(Jatropha curcas L.)成熟种子采自四川攀枝花地区。采收暖房中萌发后生长2个月的叶片, 根据Wang等(1996)的方法提取麻疯树核基因组DNA。烟草(Nicotiana tabacum) 品种为NC98, 由本实验室保存并繁殖。大

6、肠杆菌(Escherichia coli)菌株JM109、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 菌株EHA105及收稿日期: 2007-10-10; 接受日期: 2007-12-11基金项目: 国家自然科学基金(No.30670204)、国际科学技术合作项目(No.2004DFB00300, No.2006DFB63400)和教育部科技重点项目(No.104151)* 通讯作者。E-mail: qxb_2003408植物学通报 25(4) 2008质粒pBI121 等均由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 PCR 扩增curcin 5端序列根据curcin 全长基

7、因(GenBank No. AF469003)设计PCR 反应引物, 序列如下: 引物P1F, 5-(HindIII)-AATATTGGAATAGAAGACTTTG-3; 引物P2R, 5-CCA(BamHI)-CAAATATCA-TTATACGAATACG-3。扩增所用酶为Vent DNA 聚合酶(New England Biolabs)。PCR程序如下: 95C 5分钟; 94C 40秒, 56C 40秒, 72C 2分钟, 循环35 次;72C 8分钟。在PCR产物3末端加腺嘌呤核苷酸后,连接入pMD18-T 载体, 转化大肠杆菌JM109 感受态细胞, 获得阳性转化子后经专业公司测序鉴

8、定正确性。1.2.2 植物表达载体的构建将含有curcin基因启动子的重组质粒(pMD18-CP1)经HindIII和BamHI双酶切, 回收目的片段。将pBI121载体(Chen et al., 2003)进行同样的双酶切, 去除花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)35S启动子片段, 回收载体大片段, 与目的片段连接, 转化JM109感受态细胞。在含100 mg.L1卡那霉素(Kan)的LB培养基上进行初步筛选, 提取阳性克隆的质粒进行酶切鉴定,得到重组质粒pBI121-CP1(图 1)。1.2.3 烟草的转化分别将pBI121和pBI121-CP1

9、质粒用直接法导入农杆菌EHA105感受态细胞中(Hoekema et al., 1983; Komariet al., 1996), 然后采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法(Horsch et al., 1985), 获得转基因烟草植株。烟草培养温度均为28C, 相对湿度为70%。1.2.4 转基因烟草的PCR鉴定和Southern杂交检测取转基因烟草植株的叶片, 用改良的CTAB法(Wang etal., 1996)提取总DNA。根据pBI121的序列(GenBankNo.AF485783), 设计如下引物: 引物P3F, 5-AGAGGCTTACGCAGCAGGTCTC-3; 引物P4R, 5

10、-GGAAGGGTCTTGCGAAGGATAG-3, 用于检测pBI121质粒的转化植株。此外, 引物P1F和P2R用于检测pBI121-CP1质粒的转化植株。选取PCR检测为阳性的植株, 用HindIII对其基因组DNA 进行消化, 0.8%琼脂糖凝胶电泳分离, 再转移到尼龙膜上固定(Sambrookand Russell, 2002)。采用PCR-DIG探针标记试剂盒以引物对(5-CAGGAAGTGATGGAGCATCAG-3和5-TCGTGCACCATCAGCACGTTA-3)制备地高辛标记的-葡萄糖醛酸酶基因(GUS) 探针片段(638 bp)。最后采用地高辛标记和检测试剂盒进行杂交和

11、显色处理。1.2.5 GUS活性荧光分析采用荧光分析法(Jefferson et al., 1987)测定转基因烟草各组织器官的-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性。以单位时间内单位蛋白产生4-methylumbelliferone(MU)的量比较各启动子对GUS表达的影响。取5 组数据的平均值作为本次实验的结果。实验设3次重复, 取3次实验数据的平均值进行比较。分别取根、幼叶(5 cm)、幼茎、花(花后2天, 2 DAF)、种子(20 DAF)、叶片(20 cm)、茎和成熟种子(35 DAF)作为材料。取0.5 g样品置于预冷的研钵中, 加0.5 mL预冷的研磨缓冲液(0.05 mol.L1 NaH

12、PO4 pH 7.0, 0.1% SDS, 0.01 mol.L1 EDTApH 8.0, 20%甲醇, 0.1% Triton X-100, 0.1% -巯基乙醇), 迅速研磨成匀浆后转入预冷的1.5 mL离心管中,2 800g, 4C离心10分钟, 上清液即为GUS 蛋白粗提取液。按照Jefferson等(1987)的方法进行酶促反应, 在365 nm激发光下测定酶反应产物的455 nm荧光强度。同时采用Bradford法测定蛋白质含量(Bradford,1976)。1.2.6 GUS活性的组织化学染色分析根据Jefferson等(1987)的方法, 将待测烟草样品与含X-gluc底物的染

13、色反应液(0.5 g.L1 X-gluc, 0.075 mol.L1 Na2HPO4, pH 7.0, 0.05 mmol.L1 K3Fe(CN)6,0.05 mmol.L1 K4Fe(CN)6, 0.01 mol.L1 EDTA, pH8.0, 20%甲醇, 0.1% Triton X-100)于37C保温过夜,秦小波等: 麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析409用75%乙醇脱色, 观察并照相。(TGCAAAG)(Wu et al., 2000)。其它光诱导、激素诱导、病原体诱导以及脱水应答相关的启动子基序也普遍存在于该启动子中(Higo et al., 1999),

14、 例如GT-1结合位点(GRWAAW, R=A/G, W=A/T)、I-box(GATAA)、MYB识别位点(YAACKG, Y=C/T, K=G/T)和W-box(TTGAC)等。根据上述分析结果, 该CP1片段极有可能就是驱动curcin表达的特异性启动子片段。因此将CP1片段插入pBI121载体中, 置换其中的CaMV 35S启动子, 构建成为一个植物表达载体(图1), 同时用pBI121质粒本身作为对照进行后续分析。2 结果与分析2.1 麻疯树毒蛋白(curcin)基因5调控区的分离及分析利用引物P1F和P2R, 从麻疯树基因组DNA中扩增得到一条长度为620 bp的片段CP1(Gen

15、Bank No.EF612739)。分析该序列发现, 它与之前登录到GenBank 上的一条序列(No. AF469003)有90%以上的相似性, 其差异主要表现在一些零散的单核苷酸多态位点以及短的重复序列插入或缺失。在植物启动子元件预测数据库中对该序列进一步分析显示, 该片段含有1个TATA盒和3个CAAT盒。同时, 还存在一些与胚乳特异性表达调节相关的功能元件, 例如DOFCORE(Yanagisawa, 2000)、DPBFCORE (Finkelstein andLynch, 2000) 和 E-box (Hartmann et al., 2005)等。其中, DOFCORE 是Yan

16、agisawa和Schmidt(1999)用DNA结合位点筛选实验研究一种玉米胚乳特异性DNA结合蛋白(prolamin-box binding factor, PBF)的DNA结合位点时发现的。其共有的特征序列是NNNA/TAAAGNGN, 主要位于麻疯树CP1片段中。E-box的保守基序为 CANNTG, 是控制贮藏蛋白napA在油菜种子中表达的启动子顺式作用元件, 在CP1片段中则位于预测的DOFCORE元件下游。另外, CP1中还存在与胚乳特异性表达相关的功能基序Prolamin box2.2 转基因烟草的再生及检测分析通过农杆菌的浸染和卡那霉素筛选, 共获得28株转化重组质粒pBI1

17、21-CP1的卡那霉素抗性烟草和25株转化质粒pBI121的卡那霉素抗性对照烟草。用PCR方法初步鉴定这些抗性烟草植株。对于转化重组质粒pBI121-CP1的卡那霉素抗性烟草, 使用引物P1F和P2R, 经PCR反应后, 转化成功植株DNA可以扩增到一条620bp长的片段, 从而得到鉴定。同样对于转化质粒pBI121的卡那霉素抗性对照烟草, 使用CaMV 35S启动子特异引物P3F和P4R, 可以从阳性植株中扩增到一条0.7 kb长的片段, 从而鉴定出含有质粒pBI121的对照烟草植株。通过该步骤, 进一步筛选得到了21株含重组质粒pBI121-CP1的转基因烟草和18株含质粒pBI121的对

18、照烟草(图2)。图1 表达载体构建模式图Figure 1 Strategy for construction of expression vectors410植物学通报 25(4) 2008为进一步鉴定阳性转基因植株并确定其转入片段的拷贝数, 选取GUS上一段长度为638 bp的片段作为探针, 进行Southern杂交分析。由于所构建的质粒载体上只含有1个HindIII 限制性内切酶的识别位点, 在用HindIII对转基因烟草基因组DNA进行酶切后, 探针应该与含有完整整合片段的酶切片段相结合。而且由于片段在基因组中整合的位置不同会产生不同长度的酶切片图2 转基因烟草的部分PCR分析结果(A)

19、 pBI121转基因烟草株系的PCR分析; (B) pBI121-CP1转基因烟草株系的PCR分析M: DL2000 DNA marker; C1: 相应的转染质粒阳性对照; C2: 野生型烟草; 35S-135S-8: 含有CaMV 35S启动子的各转基因烟草植株; CP1-1CP1-8: 含有CP1启动子的各转基因烟草植株Figure 2 Partial results of PCR analysis of transgenic plants(A) PCR analysis of putative transgenic tobacco plants trans-formed with pB

20、I121; (B) PCR analysis of putative transgenictobacco plants transformed with pBI121-CP1M: DL2000 DNA marker; C1: The corresponding plasmid usedfor transformation as positive control; C2: Non-transgenic to-bacco plants as negative control; 35S-135S-8: Transgenictobacco plants containing CaMV 35S prom

21、oter; CP1-1CP1-8:Transgenic tobacco plants containing CP1 promoter段, 因此杂交分析中的条带数即可以代表转基因植株中整合的目的片段的拷贝数。通过分析, 确定阳性植株中被整合入烟草基因组中的目的片段有13个拷贝(图3)。2.3 GUS活性定量分析和启动子活性比较在T0代转基因烟草中, 对每一转基因系的10株PCR阳性植株进行GUS活性定量分析。根据Southern杂交结果, 为避免转基因烟草中目的片段插入位置不同造成的影响, 从每一转基因系中GUS活性值相近的多数植株中选取3株进行T1和T2代的培育并进一步分析。在T1代中, 选取

22、每个转基因系中的5株PCR阳性植株进行GUS活性检测, 以检测到的平均GUS活性值来衡量每个启动子的活性。图4A显示了T0代转基因烟草茎、叶和种子组织中的GUS活性情况。从中可以看出, 在CP1转基因烟草系中, 种子的GUS活性(84.23 nmol 4-MU.min1.mg1protein)最高, 而叶片(0.19 nmol 4-MU.min1.mg1protein)和茎(0.12 nmol 4-MU.min1.mg1protein)中的GUS活性很图3 转基因烟草的Southern杂交分析WT: 野生型烟草; 35S-3、35S-4、35S-7和35S-8: pBI121转基因烟草植株;

23、CP1-1、CP1-4、CP1-6、CP1-8和 CP1-9:pBI121-CP1转基因烟草植株Figure 3 Southern hybridization analysis of transgenic to-bacco plantsWT: Non-transgenic tobacco plants; 35S-3, 35S-4, 35S-7 and35S-8: Transgenic tobacco plants transformed with pBI121;CP1-1, CP1-4, CP1-6, CP1-8 and CP1-9: Transgenic tobaccoplants tran

24、sformed with pBI121-CP1秦小波等: 麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析411低, 可以忽略不计。而在含有CaMV 35S启动子的转基因烟草系中, 各组织中的GUS活性都较高。通过对CP1和CaMV 35S启动子的活性进行比较, 发现前者在烟草种子中的活性略低于后者。在T1代转基因烟草中, 进一步对CP1和CaMV 35S启动子进行了时空表达方面的检测(图4B)。结果发现,除种子外, CP1转基因烟草植株的根、幼茎、幼叶、图4 转基因烟草中的启动子活性分析(A) 启动子在T0代转基因烟草中的活性比较; (B) 启动子在T1代转基因烟草中的时空表达分析

25、WT: 野生型烟草; 35S: 转入35S 启动子的阳性对照烟草; CP1: 转入curcin基因启动子片段(0.6 kb)的烟草1: 根; 2: 幼茎; 3: 幼叶; 4: 花瓣; 5: 花萼; 6: 雄蕊; 7: 柱头; 8: 子房;9: 成熟叶片; 10: 茎; 11: 花后20天的种子; 12: 花后35天的种子Figure 4 Analysis of promoter activity in transgenic plants(A) Comparison of promoter activity in first generation oftransgenic plants (T0)

26、; (B) Temporal and spatial analysis ofpromoter activity in next generation of transgenic plants (T1)WT: Wild type tobacco plants as negative control; 35S:Transgenic plants integrated 35S promoter as a nominally con-stitutive control; CP1: Transgenic plants integrated 5 flankingfragment of curcin gen

27、e(0.6 kb)1: Root; 2: Young stem; 3: Young leaf; 4: Petal; 5: Calyx; 6:Stamen; 7: Stigma; 8: Ovary; 9: Mature leaf; 10: Mature stem;11: 20-DAF seed; 12: 35-DAF seed花瓣、花萼、雄蕊、柱头、子房、叶片和茎组织中的GUS活性都非常低, 可以忽略不计。T1代CP1转基因烟草系开花后20天的种子中表现出较低的GUS活性, 但开花后35天则显示出很高的GUS活性。在含有CaMV 35S启动子的对照烟草株系中, 除幼茎外, 其它各组织中的GUS活

28、性都较高。由此表明CP1启动子的种子偏好性表达起始于转基因烟草种子发育的某个时期。与CaMV 35S启动子在几乎所有的组织和发育阶段都能表达的特点相比, CP1启动子片段的表达更加独特和专一。2.4 组织化学染色分析为进一步了解CP1片段在种子发育过程中具有的时空表达驱动特性, 将T1代转基因烟草在开花前一天套袋,使其自花授粉。然后收集授粉后不同发育时期的果实,进行GUS表达的组织化学定位分析。分析发现, GUS组织化学染色的蓝色斑点首次出现于胚胎发育进入心形胚后, 然后一直持续到成熟种子时期, 并且严格定位于胚乳区域(图5)。这表明CP1启动子在麻疯树自身体系中的时空表达模式及发育中的调控机

29、制与在异源植物体系烟草中的情况非常相似。因此, CP1片段应该是一个胚乳特异性的启动子, 并包含了至少大部分的顺式调控元件。3 讨论在本研究中首次对麻疯树curcin基因的5上游CP1序列进行了克隆和分析。结果显示, 该片段富含胚乳和种子特异的启动子元件, 不仅在转基因烟草植株中具有启动子活性, 同时还严格地将其下游基因的表达限制在转基因植株心形胚时期以后的种子胚乳中, 这种情形与curcin在麻疯树种子中的表达积累情况相吻合, 因此该片段应该就是调控curcin基因表达的启动子。同时研究也证实麻疯树中的启动子在烟草等其它异源植物中也能发挥作用。但还需进一步开展更深入的研究工作。本实验室早期的

30、研究数据显示, 麻疯树中curcin毒蛋白的含量至少可占种仁总蛋白含量的13.5%, 这表明412 植物学通报 25(4) 2008 CP 1 启动子在内源体系中的活性应强于 CaMV 35S 启 动子。然而本实验通过对 GUS 活性分析表明, 在转基 因烟草中 CP1 启动子的表达活性不及 35S 启动子。造 成这种现象的原因可能有 2 个。其一是 c urc in 的表达 除了现有 CP 1 片段之外, 在其上游、下游或其它位置 还存在另外的表达增强元件, 能够提高 curcin 的表达水 平; 或者由于烟草和麻疯树本身的差异, 导致在烟草胚乳 细胞中缺乏促进 curcin 表达的反式调控

31、因子, 因此使得 其表达未达到应有的水平。其二, 本实验中 35S 启动子 启动的 GUS 表达水平相对高于之前报道的在烟草中的 表达水平(Jefferson et al., 1987), 可能也存在一定影响。 此外, 各种生物和非生物胁迫条件对CP 1片段表达 的影响还有待研究。早期的关于其它植物核糖体失活 蛋白的研究报道以及本实验室的前期研究结果表明, 一 些核糖体失活蛋白基因的表达与胁迫条件息息相关, 而 尽管预测分析显示 CP 1 片段中有一些病原诱导 、脱水 诱导的应答元件(Higo et al., 1999), 但它是否真正参与 了这种调控还不得而知。 图5 烟草种子的 GUS 活

32、性组织化学染色纵切图 分析还显示其它植物基因启动子中与胚乳特异性表 达相关的顺式元件也出现在 c u rc in 基因的启动子中 。 因此, 为了进一步研究该启动子中与胚乳特异性表达相 关的顺式元件的功能特征, 更加深入的启动子缺失和突 变分析以及对其它远端调控因子和相关反式转录因子的 研究是必要的 。 由于CaMV 35S启动子不能满足启动目的基因在特 定组织中表达的要求, 而在植物生物反应器的研究中种 子是作为反应器的重要器官。因此, 能有效启动基因在 种子中进行特异表达的启动子和顺式调控元件显得尤为 重要。此外, 分离和比较种子特异性表达的启动子还有 助于揭示组织特异性、相对启动活性和发

33、育进程中的 时空调节与序列之间的关系, 同时有助于发现顺式调控 序列的新特性, 从而满足遗传工程的特定要求。 em: 胚; en: 胚乳 (A) 转入 CaMV 35S 启动子的转基因烟草种子, 胚和胚乳均染上 蓝色; (B) 野生型烟草成熟种子, 均不能染上蓝色; (C) 转入 CP1 启动子的转基因烟草成熟种子, 仅胚乳被染上蓝色; (D) 野生型烟草心形胚时期的种子, 均不能染上蓝色; (E) 转入CP1启动子的转基因烟草心形胚时期的种子, 仅胚乳被染 上蓝色 Figur e 5 His toc hemical analys is of GUS activity in tobac co

34、seed pod longitudinal sec tions em: Embr yo; en: Endosperm (A) Seed of transgenic tobacco c ontaining CaMV 35S promoter, w ith both embr yo and endos per m s tained in deep blue; (B) Wild- type tobacco seed at mature embryo period, no blue is visible; (C) Seed of tr ans genic tobac co containing CP1

35、 at matur e embr yo period, the full of the endosper m is the only main region w hich show s GUS activity; (D) Wild-ty pe tobac co seed at hear t-s hape embryo period, no blue is vis ible; (E) Seed of transgenic tobacco containing CP1 at heart- shape embr yo per iod, only the main r egion of develop

36、mental endosperm is stained in blue 参考文献 王小行, 彭峰, 牛冬云, 李钢, 陈放 (2006). 麻疯树脂酶全长基因克 隆、表达及其蛋白质结构预测. 植物学通报 23, 634641. 秦小波等: 麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析413Sambrook J, Russell D ( 黄培堂等译 ) (2002). 分子克隆实验指南 (第3版). 北京: 科学出版社. pp. 656675.Barbieri L, Battelli MG, Stirpe F (1993). Ribosome-inactivatingprotein

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