骨髓间充质干细胞的体内示踪及其修复椎间盘退变的实验研究

1、骨髓间充质干细胞的体内示踪及其修复椎间盘退变的实验研究         11-03-25 15:51:00     编辑：studa20                      作者：曹烨，吴小涛，王运涛，严慧深，邵建树 【摘要】  目的：探讨骨髓

2、间充质干细胞(marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)的标记与体内示踪方法，及其治疗椎间盘退变的可行性。方法：取兔MSCs行体外培养，并在体外纯化扩增，用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记后分别于1、3、5、7 d用MTT法检测细胞活性。将标记后的细胞植入退变的椎间盘内。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化，免疫组化法测定型胶原含量的变化，用MR扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪。所得数据进行统计学处理。结果：MTT法结果显示，SPIO对MSCs的生物活性无影响，MS

3、Cs能被SPIO有效标记。运用MR扫描可观察到其在体内的分布，并发现干细胞向周边发生了迁徙。8周内实验组髓核蛋白多糖和型胶原的含量高于模型组，差异有统计学意义。结论：SPIO可有效地标记MSCs并行体内活体示踪，且不影响细胞活性，是理想的示踪剂。SPIO标记后的MSCs移植能增加髓核中细胞外基质的含量，从而延缓椎间盘退变。 【关键词】  骨髓间充质干细胞; 超顺磁性氧化铁; 磁共振成像; 椎间盘退变; 兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)具有较强的自我更新和分化为多种成熟细胞的能力，由于它的这种特性，被广泛地应用于细胞组织工

4、程中作为种子细胞进行研究。目前MSCs移植治疗疾病已在动物模型中取得初步成效，但MSCs移植后如何在活体内监测其存活、分布及迁徙情况仍需要做进一步的研究。随着分子成像技术的发展，应用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)标记干细胞，已成为体内示踪的重要手段12。目前已有研究显示，移植MSCs可能成为治疗椎间盘退变的一种新方法。本研究旨在探讨SPIO对细胞生物活性的影响及体内示踪效果，标记的干细胞移植是否能有效治疗椎间盘退变。1 材料和方法1.1 主要材料和试剂LGDMEM培养基(美国Gibco公司)，100%胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、M

5、TT(美国Sigma公司)，抗型胶原抗体(美国ADL公司)，DMSO(二甲基亚砜，西安化学试剂厂)，酶联免疫酶标仪(550型)(美国BIORAD公司)，1.5 T MR仪(荷兰Philips公司);新西兰大白兔由东南大学医学院动物中心提供。1.2 实验方法取MSCs细胞悬液进行计数，调整细胞密度为1×106 ml-1并行台盼蓝染色。镜下观察，在3 min内用血细胞计数板分别计活细胞和死细胞数，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。3、L34、L45椎间隙，用21号针头针刺抽吸椎间盘，抽出组织湿质量45 mg。造模成功后

6、，术后2周，把模型兔随机分为实验组及模型组，每组各12只，同上述手术方法，实验组在对应的椎间盘内注射SPIO标记的干细胞悬液25 l，模型组在对应的椎间盘内注射磷酸缓冲液(PBS)25 l，在每个相应椎间盘旁的腰大肌处以黑色缝合线作标记,用于以后取样观察。然后冲洗、止血，依次逐层关闭切口。术后每日定期观察切口情况，肌肉注射抗生素预防感染。1.3 统计学处理运用SPSS 15.0软件进行统计学分析。结果用x-±s表示。多组间比较运用单因素方差分析F检验，组间两两比较采用SNK检验，检验水准=0.05。2 结 果2.1 兔MSCs原代培养生长及形态观察原代细胞接种后24 h即有细胞开始贴

7、壁生长，呈类圆形或细小梭形;57 d后细胞集落逐渐增多扩大，并彼此融合，细胞呈现梭形外观;1012 d细胞融合达90%以上，细胞呈栅栏状、漩涡状排列，细胞间的界限不清，可以传代。MSCs的活率：传代至P3的细胞，经0.25%的胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，台盼蓝排斥试验检测细胞活率达95%。2.2 SPIO标记的干细胞SPIO标记的MSCs经普鲁士蓝染色后在光镜下观察，细胞胞浆内分布有大量的蓝黑色铁颗粒，标记率为100%(图1)。2.3 MTT结果相同培养时间标记细胞培养组与未标记细胞培养组之间的A值差异无统计学意义(P>0.05);随着培养时间的延长，两组的A值都逐渐增高(表1)。2.4

8、 MR扫描移植干细胞的髓核，不同时间MRI T2像对比，早期髓核T2像形成一个低信号区，周围为高信号的髓核组织，而后期的髓核T2像即表现为均一的低信号，提示SPIO标记的干细胞植入髓核内后由移植中心区向周边髓核发生迁徙(图2)。表1 两组不同培养时间的吸光度值2.5 蛋白多糖含量测定结果术后2、4、6、8周,将各组的蛋白多糖测定值经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。各组间再行两两比较采用SNK检验。各个时间点实验组与模型组及模型组与对照组之间，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。表2 不同时期各组髓核蛋白多糖含量2.6 病理学检测结果实验组和对照组髓核组织型胶原染色呈阳性或强阳性，模型组呈阴性或弱阳性反应(图3)。术后2、4、6、8周,各组间测定值经方差分析，差异