PCR技术及其在动物科学领域的运用

1、PCR技术及其在动物科学领域中的运用摘要：聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。近年来，PCR技术迅速发展并与其他技术结合衍生出了荧光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列新技术，运用领域也不断拓宽，已被广泛地用于微生物学、医学、免疫学等领域。本文通过介绍PCR技术及其在动物科学领域中的运用，使读者对PCR技术有初步的了解并对其运用领域有概况性的认识，更是为了今后的科学研究积累了更多的知识和提供了技术上的支持。关键词：荧光定量PCR RT-PCR 探针 引物

2、（一）PCR技术简介及其运用概述聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction）， 简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何DNA、RNA的地方。聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。1、PCR技术原理双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与

3、下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝，在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。2、PCR工作原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至9095一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引

4、物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至5560，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3、PCR种类及运用（1）、RT-PCR 原理：首先提起RNA，然后用逆转录酶与MRNA为模板进行CDNA第一链的合成，其原理同PCR.。RT-PCR

5、是个半定量的试验，可以确定在MRNA水平的表达差异，即在转录水平 。（2）、免疫PCR(immuno polymerase chain reaction , IPCR ) 原理：是用一段已知DNA 分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR 扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA 分子,电泳定性,根据特异性PCR 产物的有无来判断待测抗原是否存在。免疫PCR是迄今最敏感的一种抗原检测方法,理论上可以检测单个抗原分子,但实践中它的敏感性受许多因素的影响,如连接分子、显示系统的选择、DNA 报告分子的浓度、PCR 循环次数等。由于PCR 产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比

6、,因此免疫PCR 还可用于抗原的半定量试验。 （3）、巢式PCR 原理：是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段。先用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增. 巢式PCR比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA 。（4）、实时荧光PCR 原理：利用荧光来检测PCR产物，PCR每循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定CT值，从而确定其实DNA拷贝数 。实时PCR，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。实时PCR的定量使用荧光色素，目前有二种方法，一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧

7、光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭基团则在3末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收PCR扩增时，Taq酶的5'3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测

8、到。real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”。（5）、原位PCR技术：原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为：固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先

9、用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K.PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。显微镜观察结果，另外还有膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR等30几种PCR。（二）PCR在动物科学领域中的运用1、PCR在动物产品检测

10、领域的运用随着人们生活水平的提高，人们开始越来越关注饮食的健康与安全。近年来，我国的畜牧业发展迅速，动物产品的产量连年增长。但发展过程中也出现了不少的问题，动物产品的质量安全问题就尤为突出，学有效的检测手段成了我们保障饮食健康的一道关卡。PCR技术不断取得突破，现已成为检测食品卫生安全的有效手段。唐吉思【9】定量PCR运用于牛乳中金黄色葡萄球菌（S.aureus)的检测，实验中，针对S.aureus SEA基因片段设计一对引物，将构建的重组质粒作为阳性对照，建立S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-timePCR的检测方法。实验发现该方法具有较好的特异性和敏感性

11、，能够快速检测牛乳中的金黄色葡萄球菌。刘胜贵【1】PCR技术检测猪肉中沙门氏菌，对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检测。对不同稀释度的样品进行PCR扩增，当DNA含量只有0.01pg时，还能扩增出条带，说明该方法检测猪肉中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点。李敏【2】表明，将免疫磁珠技术（IMS)与多重PCR结合，24h内即可检测出食品中的单增李斯特菌，最低检测限可达1cfu/25g(mL)。李苗云【3】冷却猪肉贮藏过程中微生物的变化，直接提取不同冷藏天数肉样DNA，对细菌16SrDNA的v6-v8区段进行PCR扩增，通过DGGE及序列分析，结果表明，冷却猪肉好氧贮藏过程中的

12、主要微生物有：热杀索丝菌、莫拉式菌、气单胞菌、假单胞菌、葡萄球菌和节杆菌，快速检测冷却猪肉中微生物污染提供了新手段。2、PCR在动物疫病防治领域的运用 PCR（聚合酶链反应）是利用DNA聚合酶在体外大量扩增两段已知序列之间的某一特定DNA片段(又称模板)的分子生物学技术。这种技术可以利用几乎所有的临床样品探查病原体基因的存在和变异，从而对生物体的状态和疫病作出诊断。因而,如何从被检临床样品中高效、简便地提取核酸作为模板，就成为普及、推广PCR技术检测动物疫病亟待解决的问题。 近年来，荧光定量PCR在病原体检测方面得到了广泛的运用。罗宝正【6】等将TaqMan探针荧光PCR运用到猪副嗜血杆菌的检

13、测并使HPS和大肠杆菌0517、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌分开，蔺文成【11】等利用TaqMan探针荧光RT-PCR方法对猪细小病毒（ppv）感染的ST细胞48小时后JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2mRNA转录水平的检测发现JAK-1和JAK-2转录水平显著上调，STAT-1和STAT-2转录水平显现下调趋势证实该方法适用于猪细胞传导因子JAK和STAT的定量检测，许红丽【10】等运用荧光定量RT-PCR对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测，检测中，根据犬瘟热病毒（CDV）核衣壳蛋白（NP）基因序列设计一对特异引物，扩增NP基因，并以NP基因重组质粒作为阳性

14、标准品，建立CDV的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR方法。实验结果表明：较常规RT-PCR该方法敏感性提高100倍，可以用于CDV病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供快速而敏感的检测。杨少华【12】等建立了禽流感病毒RT-PCRELISA诊断方法，通过对A型禽流感（AI）保守的M基因设计引物，并分别用地高辛和生物素标记，建立检测A型AIV的 RT-PCRELISA方法，并对反应条件进行了优化，确定了最适反应条件，使得该方法的敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍以上且特异性强，克服了样品含量少的困难，为早禽流感诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。3、PCR在饲料开发与

15、分析领域的运用在动物生产的过程中饲料的营养均衡至关重要，传统的谷物饲料一般难以满足动物对蛋白质的需要，因此需要在饲料中动物源性饲料，以满足动物生产对蛋白质的需求。近年来，由于各种疫病的流行和新的危害性极大的传染病的出现，动物源性饲料的安全性难以保证。而PCR技术则为饲料中动物源性成分的检测提供了有效地手段。于凤芹【4】等将实时荧光PCR法运用到检测饲料中鸡源性成分，根据鸡线粒体DNA 建立Taqman探针实时荧光PCR检测饲料中鸡源性成分方法，并证实该方法特异性高，极具实用价值。4、PCR在动物遗传育种、基因表达、早期胚胎鉴定领域的运用随着分子生物学的迅猛发展，研究动物遗传提供了理论依据和强大

16、的技术支持。其中PCR技术也被广泛运用于动物遗传领域的研究。赵秀华【5】R-SSCP方法检测京海黄鸡、AA鸡、尤溪麻鸡、边鸡4个鸡品种STAT5b基因5调控区部分序列的多态性，并分析其对京海黄鸡生长繁殖性状的遗传效应发现京海黄鸡STAT5b基因5控区部分序列的多态性对其生长和繁殖性状有一定影响。张跟喜【7】PCR-SSCP技术检测边鸡生长抑制素（MSTN)基因外显子的3的单核苷酸多态性，并与边鸡的繁殖性状进行关联分析发现了MSTN基因可能是影响边鸡繁殖性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。王学清【8】CR技术运用于牛早期胚胎性别的鉴定，在鉴定试验中裴翠娟等根据GenBank中收

17、录的牛Y染色体特异序列和牛基因组序列分别设计公牛特异引物和内标引物，通过对引物浓度的组合、dNTP浓度、Mg2+浓度、退火温度的筛选优化PCR反应体系，扩增牛基因组DNA和胚胎基因组DNA，建立用于牛早期胚胎性别鉴定的多重PCR反应体系，该方法能实现奶牛良种的快速扩繁。综上所述，PCR技术日新月异的发展极大地推动了动物科学领域的研究，为动物科学分子领域的提供了强大的技术支持。在未来，随着PCR技术创新，还将运用在动物科学领域其他方面，做出新的贡献。做为动物科学领域的研究者，我们应该重视PCR技术运用与创新，让这门技术能够更好地服务于社会。参考文献：【1】刘胜贵，魏麟.应用PCR技术检测猪肉中沙

18、门氏菌的研究J.科学食品，2007,28（3）：254-256.【2】 李敏，孟谨，郑小平,等.IMS-PCR对食品中单增李斯特菌快速检测J.乳业科学与技术.2010(3):1030-1032【3】 李苗云，周光宏，徐幸莲.运用PCR-DGGE研究冷却猪肉贮藏过程种的优势菌J.西北农业科技大学学报，2008,36（9）：185-189【4】 于凤芹，王金玲，庞杰，王芳，姜丽，张莹.实时荧光PCR法检测饲料中鸡源性成分.中国动物检疫，2009,05【5】 赵秀华，王金玉，等.STAT5b基因2个SNPs位点与京海黄鸡生长和繁殖性状的关联分析.中国畜牧杂志，2012,48（1）：1-4【6】 罗宝正，王振全，等.TaqMan探针荧光PCR检测副猪嗜血杆菌方法的建立和应用J.江苏农业学报，2011，27（6）：1367-1370【7】 张跟喜，赵秀华，等.肌肉生长抑制素基因外显子3的多态性及其与边鸡繁殖性状的关联分析.中国畜牧杂志，2012,48（1）：9-11【8】 王学清，裴翠娟，等.鉴别牛早期胚胎的多重PCR技术研究.华北农学报，2011,26（6）：89-93【9】 唐吉思，吴金花，等.荧光定量PCR检测牛乳中金